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.2016年2月1日；35(3):302-18.
doi:10.15252/embj.201592929。 Epub 2016年1月12日。

微管结合蛋白双皮质样激酶1（DCLK1）引导驱动蛋白3介导的货物运输至树突

乔安娜·利普卡 1, Lukas C Kapitein公司 2, 杰克·贾沃斯基 三, Casper C Hoogenraad公司 4
附属公司

微管结合蛋白双皮质样激酶1（DCLK1）引导驱动蛋白3介导的货物运输至树突

乔安娜·利普卡等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

在神经元中，小泡和其他细胞材料的极化分布是通过分子马达建立的，分子马达控制轴突和树突之间的选择性运输。目前尚不清楚驱动蛋白马达和微管结合蛋白之间的相互作用能否控制极化运输。通过筛选所有45个驱动蛋白家族成员，我们系统地研究了哪些驱动蛋白马达可以转移活细胞中的货物并驱动海马神经元的极化运输。虽然大多数驱动蛋白马达选择性地将货物运输到轴突中，但我们确定了驱动蛋白-3（KIF1）和驱动蛋白-4（KIF21）亚家族的五个成员，它们也可以靶向树突。我们发现微管结合蛋白双皮质样激酶1（DCLK1）标记树突微管的一个子集，是KIF1依赖的致密核小泡（DCV）进入树突和树突发育所必需的。我们的研究表明，微管结合蛋白可以为特定的驱动蛋白马达提供局部信号，以驱动极化货物运输。

关键词：枝晶；双皮质激素；驱动蛋白；神经元；极性。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。驱动蛋白马达传输特性的系统分析

  1. 诱导性贩运分析中使用的驱动蛋白结构的示意图。Kinesin构造包含运动域和线圈(MDC公司).

  2. 诱导过氧化物酶体贩运检测原理。余弦用截短的驱动蛋白运动构建体转染‐7细胞联邦储备委员会和GFP公司（A中总结）和过氧化物酶体聚乙烯‐mRFP公司‐FKBP公司在加入rapalog后，驱动蛋白马达被招募到过氧化物酶体中，驱动素转运特征可以作为过氧化物酶体位移来测量。

  3. 示例图像余弦‐7个表达石油醚‐mRFP公司‐FKBP公司在存在易位马达的情况下，在（上部面板）和（中部面板）添加rapalog后30分钟，KIF（基辅）1C‐MDC公司‐联邦储备委员会和非易位电机，基辅3B‐MDC公司‐联邦储备委员会黄线表示余弦‐7单元轮廓。下部面板表示按时间进行颜色编码的连续二值化图像的叠加（另请参见附录图S1）。比例尺，20μm。

  4. 表示R90%的强度-时间轨迹的曲线图余弦‐7个细胞转染石油醚‐mRFP公司‐FKBP公司和KIF（基辅）1C‐MDC公司‐联邦储备委员会(n个=13）或KIF（基辅）3B‐MDC公司‐联邦储备委员会(n个 = 10). R90%是每个时间点的半径，包括总荧光强度的90%。误差条指示扫描电镜.

  5. 添加拉帕洛30分钟后过氧化物酶体平均位移的定量表示余弦‐转染有驱动蛋白结构体的7个细胞，总结见（A）。附录表S1总结了分析细胞的数量。如果在添加rapalog后的30分钟内，激动素取代了过氧化物酶体≥5μm（用蓝色虚线标记），则视为易位体。误差条指示扫描电镜.

  6. 根据R90%的时间轨迹计算的用于移位驱动蛋白的过氧化物酶体平均分散速度的定量表示（汇总于附录图S2、附录表S1）。误差条表示SEM。

图2
图2。Kinesin家族成员在神经元中表现出不同的靶向偏好

  1. 添加拉帕洛前后过氧化物酶体分布的代表性最大强度预测DIV公司14个海马神经元表达聚乙烯‐mRFP公司‐FKBP公司,基夫1个MDC公司‐联邦储备委员会,KIF（基辅）21A‐MDC公司‐联邦储备委员会或基辅5亿美元MDC公司‐联邦储备委员会。转染细胞的形态使用锅炉给水泵填充。轴用蓝线标记。添加rapalog 30分钟后，箭头标记过氧化物酶体靶向树突（灰色）和轴突（蓝色）。比例尺，20μm。

  2. 图中显示了树突和轴突在加环斑前后的强度-时间轨迹基辅1C‐MDC公司‐联邦储备委员会(n个=6个神经元），KIF（基辅）21A‐MDC公司‐联邦储备委员会(n个=4）和KIF（基辅）5亿美元MDC公司‐联邦储备委员会(n个 = 8). 痕迹归一化为添加拉帕洛之前的平均强度，并归一化至背景。误差条指示扫描电镜.

  3. 百分比的定量表示DIV公司用图1A所示的结构转染14个神经元（如（A）所示），其中加入rapalog后过氧化物酶体重新分布到轴突（“A”，蓝条）或轴突和至少2个树突（“A+d”，红条）。如果树突在≥50%的细胞中被靶向，并且以红色突出显示，则激酶被视为“树突靶向”；附录表S1总结了分析细胞的数量。

  4. 添加拉帕洛前后过氧化物酶体分布的代表性最大强度预测DIV公司转染2个海马神经元，如（A）所示。比例尺，20μm。

  5. 百分比DIV公司2个神经元转染基辅1C‐MDC公司‐联邦储备委员会(n个=9个神经元），基辅21A‐MDC公司‐联邦储备委员会(n个=14）和基夫5B‐MDC公司‐联邦储备委员会(n个=14），其中过氧化物酶体在添加雷帕霉素后重新分布到至少2个轴突中。误差条指示扫描电镜.

  6. 神经突百分比DIV公司加入雷帕洛后，以过氧化物酶体为靶向转染as in（E）的2个神经元。误差条表示SEM。

图3
图3。DCLK公司1个调节器基辅1介导的树突运输

  1. 海马神经元的典型共焦图像(DIV公司14） 免疫染色用于地图2, β‐三微管蛋白和DCLK公司1.比例尺，20μm。

  2. 平均比率的量化DCLK公司1,地图1A、，地图1B和地图与轴突相比，树突中的微管蛋白免疫荧光强度为2。每个条件下分析6到9个细胞。误差条指示扫描电镜.

  3. 的代表性图像DIV公司用编码β-gal的质粒转染10个海马神经元4天，观察转染细胞和3个不同的DCLK公司1什核糖核酸s或DCLK公司2什核糖核酸β-gal（红色）和DCLK公司1（绿色）。比例尺，20μm。

  4. 归一化平均强度的定量分析DCLK公司感兴趣的地区有1个DIV公司转染10个神经元直流lk1股#1(n个=16个神经元），DCLK公司1股#2(n个=16）和DCLK公司1股#3(n个 = 18). 未转染细胞作为对照(n个 = 48).N个 = 2. 误差条指示扫描电镜; ***P（P）<0.001（单向方差分析然后是Tukey的多重比较测试）。

  5. 蛋白质提取物的Western blot分析示例DIV公司4个皮层神经元电穿孔DIV公司0具有质粒系统（控制）或质粒系统编码三个中的一个DCLK公司1什核糖核酸s.肌动蛋白水平用作负荷控制。

  6. 蛋白质水平的量化DCLK公司（E）中表示的1个样品。N个=3，误差条表示扫描电镜, ***P（P）<0.001（单向方差分析然后是Tukey的多重比较测试）。

  7. 过氧化物酶体分布的代表性最大投影DIV公司14个神经元转染石油醚‐mRFP公司‐FKBP公司,KIF（基辅）1摄氏度(MDC公司)‐联邦储备委员会以及指示的sh核糖核酸在加入雷帕霉素之前和之后30分钟。碱性磷酸酶共切fill以观察转染神经元的形态。轴用蓝线标记。添加雷帕洛后，箭头标记过氧化物酶体的树突（灰色）和轴突（蓝色）靶向。比例尺，20μm。

  8. 百分比的定量表示DIV公司14个神经元转染石油醚‐招标书连同其中一个KIF（基辅）1C，基辅21A或KIF（基辅）5B和指示的sh核糖核酸在加入rapalog过氧化物酶体后，再分布到轴突（“a”，蓝色条）、轴突和树突（“a+d”，红色条）或没有再分布到任何神经元室（“nt”，无靶向，灰色条）。每种情况下分析19-44个神经元；N个 = 2.

图4
图4。KIF（基辅）1驱动树突中致密核心囊泡的运输，对正确的树突形态至关重要
  1. A–G

    海马神经元表达的同时双色电影的代表帧（A，D）和波形图（B，F）NPY（净现值）‐百万立方厘米herry和其中之一KIF（基辅）1A‐GFP公司（A、B）、，BDNF公司‐GFP公司（D） 或TfR‐GFP公司（F） ●●●●。标尺，20μm（A，D）或5μm（B，F）。（C） （A，B）中描述的细胞中囊泡共定位的量化。量化表示基夫1A囊泡非营利组织阳性：左栏根据（A）中的固定细胞图像进行量化，右栏根据（B）中的波形图进行量化（仅移动分数）。（E） （D）中描述的细胞中囊泡共定位的量化：左栏表示NPY（净现值）囊泡BDNF公司正数，右栏表示%BDNF公司囊泡NPY（净现值）积极的。（G） （F）中描述的细胞中囊泡共定位的量化。左栏指示%NPY（净现值）TfR阳性的囊泡，右栏表示TfR的百分比NPY（净现值）积极的。误差条指示扫描电镜.

  2. H、 我

    定量转染海马神经元树突中小泡的游程（H）和速度（I）DIV公司10–14，连续4天NPY（净现值）‐GFP公司(n个=924次移动），TfR‐GFP公司(n个=286）或基辅1A‐GFP公司(n个=174）和形态标记锅炉给水泵.N个 = 2. 误差条指示扫描电镜; ***P（P）<0.001（单向方差分析然后是Tukey的多重比较测试）。

  3. J型

    光漂白后活细胞成像方案，以可视化标记有NPY（净现值）‐GFP公司海马神经元近端树突中的（H，I，K，L）或TfR阳性再循环内体(DIV公司14).

  4. K

    代表性的波形图NPY（净现值）‐GFP公司转染神经元初级树突中标记的致密核小泡运动。DIV公司10–14个海马神经元与编码质粒共转染4天非营利组织‐GFP公司,碱性磷酸酶填充或基辅21什核糖核酸混合(n个 = 30),KIF（基辅）1什核糖核酸混合(n个 = 31),KIF（基辅）1A什核糖核酸(n个 = 19),基辅10亿股核糖核酸(n个=19）或KIF（基辅）1C股核糖核酸(n个 = 11).质粒系统用作控件(n个 = 15). 比例尺，5μm。

  5. L（左）

    量化光漂白后100 s内从（K）进入神经元初级树突的致密核小泡平均数量。N个 = 2–3. 误差条指示扫描电镜; ***P（P）<0.001（单向方差分析然后是Tukey的多重比较测试）。

  6. M（M）

    TfR的代表性曲线图‐GFP公司初级树突中标记的再循环内体运动。DIV公司10–14个海马神经元与TfR‐GFP公司与一个锅炉给水泵填充和a基辅1什核糖核酸混合(n个=11）。质粒系统用作对照(n个 = 20). 比例尺，5μm。

  7. N个

    50s内从（M）循环进入神经元初级树突内体条目平均数量的量化。N个 = 2. 误差条指示扫描电镜.ns，不显著（Mann–Whitney检验）。

  8. O（运行）

    海马神经元的代表性图像(DIV公司4） 与一个空的质粒系统（控制）或质粒系统对指示的sh进行编码核糖核酸与一个GFP公司填充固定在DIV公司8和免疫染色地图2和钠通道(自动识别系统). 比例尺，50μm。

  9. P（P）

    （O）中所述细胞的Sholl分析。误差条指示扫描电镜; *P（P） < 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001（双向方差分析Bonferroni的测试事后（post-hoc）测试）。

  10. 问

    分析（O）中描述的细胞树突状总长度。误差条指示扫描电镜; *P（P） < 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001（单向方差分析然后是Tukey的多重比较测试）。每个条件下分析21–24个神经元（n）；N个 = 2.

图5
图5。DCLK公司1调节致密核心囊泡进入树突
  1. A类

    的方案DCLK公司1个截断构造。

  2. B类

    转染神经元近端树突中致密核心囊泡运动的代表性描记图。DIV公司将10-14个海马神经元与非营利组织‐GFP公司和质粒系统（控制）或质粒系统编码DCLK公司1什核糖核酸在…缺席或在场的情况下DCLK公司在活细胞成像过程中，记录了树突中的截短结构和致密核小泡运动。比例尺，5μm。

  3. C类

    量化在光漂白后100 s的实时记录期间，如（B）所示转染神经元树突的致密核心囊泡平均进入数。每个条件下分析10–32个细胞。误差条指示扫描电镜; ***P（P）<0.001（Kruskal–Wallis测试，然后是事后（post-hoc）邓恩测试）。N个 = 2. *P（P）< 0.05.

  4. D、 E类

    DIV公司将10–14个海马神经元与任一细胞共转染4天质粒系统（控制，n个=20个神经元）或DCLK公司1什核糖核酸以及TfR‐GFP公司(n个 = 16). （D） 树突中循环内体运动的典型波形图。比例尺，5μm。（E） 在光漂白后的50 s实时记录期间，对进入树突的再循环内体条目的平均数量进行量化。误差条指示扫描电镜; ns，不显著（Mann-Whitney检验）。N个 = 2.

图6
图6。DCLK公司1优先与微管子集结合
  1. A类

    蛋白质印迹分析的例子直流lk1和直流电源蛋白质提取物中的含量DIV公司1,DIV公司7,DIV公司14，和DIV公司21个海马神经元。微管蛋白水平用作负荷控制。

  2. B类

    海马神经元的代表性图像(DIV公司14） 免疫染色用于DCLK公司1和β‐三微管蛋白。比例尺，20μm。

  3. C、 D类

    代表性图像余弦‐7细胞转染DCLK公司1‐GFP公司（C） 或DCLK公司1(Δ杜兰特)‐GFP公司（D） 去酪氨酸化、酪氨酸化或α-微管蛋白染色。比例尺，20μm。

  4. E类

    代表性图像余弦‐7细胞转染DCLK公司1‐GFP公司和标记招标书‐电子束并在活细胞成像过程中进行记录。绘制了代表性的日晷图（在标有白色方框的区域上），表明DCLK公司1‐GFP公司与电子束3‐标签招标书‐T。比例尺，20μm。

图7
图7。DCLK公司1名员工KIF（基辅）1并且不影响树突中微管的极性
  1. A类

    的摘录DIV公司7个海马神经元电穿孔质粒系统控制或具有三个不同的DCLK公司1什核糖核酸的DIV公司用所示抗体对样品进行Western blot分析。

  2. B类

    转染at的海马细胞的代表性图像DIV公司10和招标书（可视化转染细胞），质粒系统（控制）或DCLK公司1什核糖核酸，固定于DIV公司14和染色电子束3.黑线表示神经元胞体轮廓。比例尺，10μm。

  3. C、 D类

    数量的量化电子束树突（C）和胞体（D）中有3颗彗星。每种情况下分析25-26个神经元，N个 = 2. 误差条指示扫描电镜, ***P（P） < 0.001, **P（P）<0.01（未配对t吨‐测试）。

  4. E–H（E–H）

    海马神经元与MACF公司18‐GFP公司和质粒系统（控制）或DCLK公司1什核糖核酸并使用生命细胞显微镜追踪树突中微管的动力学。（F） 具有和不具有光消融的树突中动态微管末端生长的代表性kymograph。比例尺，10μm。（G，I）量化MACF公司18个事件在（G）和（I）光消融前后在树突中逆行和顺行移动。每种情况分析18个神经元；N个 = 2. （H） 光消融后活细胞成像方案。

  5. 一、 J型

    生物素下拉列表(PD公司)摘自HEK公司293个转染生物素标记的细胞DCLK公司1和（I）KIF（基辅）1A‐MDC公司‐哈‐联邦储备委员会,KIF（基辅）1C‐MDC公司‐哈‐联邦储备委员会,KIF（基辅）5亿美元MDC公司‐哈‐联邦储备委员会构造并探测哈/DCLK公司1或（J）不同GFP公司‐标记KIF（基辅）1A截断构造和探测GFP公司/DCLK公司1.所有下拉实验的输入/颗粒比率为2%。

  6. K

    GFP公司从HEK公司293个细胞转染DCLK公司1个碎片和KIF（基辅）1A‐MDC公司‐哈‐联邦储备委员会,KIF（基辅）1C‐MDC公司‐哈‐联邦储备委员会和基辅1C‐医学博士‐哈并进行了探索哈/GFP公司LacZ‐哈用作阴性对照。

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