Breast primary epithelial cells that escape p16-dependent stasis enter a telomere-driven crisis state

doi:10.1186/s13058-015-0667-z

.2016年1月13日；18(1):7.

doi:10.1186/s13058-015-0667-z。

逃避p16依赖性停滞的乳腺原代上皮细胞进入端粒驱动的危机状态

Purificación Feijoo公司¹, 玛丽奥娜·特拉达斯², 大卫·索勒^三, 丹尼尔·多明格斯⁴, 劳拉·图塞尔⁵, 安娜·基内斯卡⁶

附属公司

¹巴塞罗那奥托诺马大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193，西班牙贝拉特拉。purificacion.feijoo@uab.es。
²巴塞罗那自治大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193，西班牙贝拉泰拉。mariona.terradas@uab.es。
^三巴塞罗那奥托诺马大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193，西班牙贝拉特拉。david.soler@uab.es。
⁴巴塞罗那奥托诺马大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193，西班牙贝拉特拉。daniel.dominguez@uab.es。
⁵巴塞罗那奥托诺马大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193，西班牙贝拉特拉。laura.tusell@uab.es。
⁶巴塞罗那奥托诺马大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193，西班牙贝拉特拉。anna.genesca@uab.es。

PMID： 26758019
预防性维修识别码：项目经理4711177
内政部： 10.1186/s13058-015-0667-z

逃避p16依赖性停滞的乳腺原代上皮细胞进入端粒驱动的危机状态

Purificación Feijoo公司等。乳腺癌研究. 2016.

.2016年1月13日；18(1):7.

doi:10.1186/s13058-015-0667-z。

作者

Purificación Feijoo公司¹, 玛丽奥娜·特拉达斯², 大卫·索勒^三, 丹尼尔·多明格斯⁴, 劳拉·图塞尔⁵, 安娜·基内斯卡⁶

附属公司

¹巴塞罗那奥托诺马大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193，西班牙贝拉特拉。purification.fiejoo@uab.es。
²巴塞罗那奥托诺马大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193，西班牙贝拉特拉。mariona.terradas@uab.es。
^三巴塞罗那奥托诺马大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193，西班牙贝拉特拉。david.soler@uab.es。
⁴巴塞罗那奥托诺马大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193，西班牙贝拉特拉。daniel.dominguez@uab.es。
⁵巴塞罗那奥托诺马大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193，西班牙贝拉特拉。laura.tusell@uab.es。
⁶巴塞罗那奥托诺马大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193，西班牙贝拉特拉。anna.genesca@uab.es。

PMID： 26758019
预防性维修识别码：项目经理4711177
内政部： 10.1186/s13058-015-0667-z

摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性疾病，但乳腺癌生物学仍存在一些基本问题。为了回答这些问题，开发了几种细胞模型。最近，利用改进的细胞培养条件，开发出了具有一定管腔特征的新的原代细胞模型。这个模型是相关的，因为在引入一组特定的遗传元素后，转化细胞在小鼠体内产生类似人类腺癌的肿瘤。使用改良的细胞培养条件支持这些乳腺原代上皮细胞的生长，有望延缓或消除应激诱导的衰老，并导致正常细胞的增殖。然而，尚未进行任何研究来调查这些问题。在Primaria平板上的WIT培养基中进行乳腺原代上皮细胞的繁殖。免疫荧光、western blot和qRT-PCR检测分子标记，并检测DNA损伤反应通路的完整性。通过焦磷酸测序评估p16（INK4a）启动子甲基化。为了获得培养过程中染色体不稳定性随时间变化的动态图像，我们应用了FISH方法。为了更好地将染色体不稳定性与过度端粒磨损联系起来，我们使用慢病毒载体引入了端粒酶逆转录酶人类基因。我们在这里报道，在Primaria平板上用WIT培养基体外繁殖的乳腺原代上皮细胞表达一些管腔特征，但不是完整的管腔谱系表型。他们经历了p16依赖性应激诱导的衰老（停滞期），摆脱停滞期的细胞最终进入危机状态，染色体严重不稳定。这些细胞中的染色体不稳定是由端粒过度磨损引起的，因为染色体畸变的分布与端粒无信号末端的分布相关。重要的是，人类TERT基因的异位表达挽救了他们的染色体不稳定表型。从本质上讲，我们的数据表明，与之前的建议相反，改善培养条件以在体外繁殖具有某些管腔特征的乳腺上皮细胞并不能防止应激诱导的衰老。p16（INK4a）启动子的自发甲基化可以克服这一障碍，从而使端粒功能障碍的细胞增殖并导致染色体不稳定。

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数字

图1
人类乳腺上皮细胞的特征。一两种人类乳腺上皮细胞类型（乳腺原代上皮细胞）的衍生步骤示意图(*BPEC公司*)和人类乳腺上皮细胞(*HMEC公司*).b条BPEC和HMEC的图像显示：我在WIT培养基和具有改良附着表面的组织培养板上生长的BPEC（Primaria）；二在乳腺上皮生长培养基（MEpiCM）和常规培养板上生长的HMEC；三和四、管腔特异性Claudin-4的检测(绿色)和肌上皮特异性CD-10(红色)免疫荧光法检测BPEC和HMEC中的蛋白质。**c（c）**Claudin-4免疫荧光检测后乳腺样本的石蜡切片(绿色)和CD-10(红色).d日检测Claudin-4，p16的Western blot^INK4a公司基础p53与人端粒酶逆转录酶(小时)BPEC早期、中期和晚期种群加倍（PD），HMEC处于停滞前和停滞后；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(*GAPDH公司*)用作加载控制。**e（电子）**对CD-227和CD-10的BPEC和HMEC培养物进行分类。如果角蛋白的免疫荧光检测14(*K14号公路*)和19(*K19号公路*)关于BPEC和HMEC文化。在BPEC培养物中，我们发现K14阳性细胞和K19阳性细胞(我和**ii（ii）**). 但在HMEC文化中(三)，我们只观察到K14阳性细胞。克通过qRT-PCR获得的12BPEC、14BPEC和HMEC中K19的mRNA水平。小时Western blot检测辐照和非辐照BPEC中基础p53和s15磷酸化形式的p53。*DAPI公司*4'，6-二氨基-2-苯基吲哚

图2
人类乳腺上皮细胞的繁殖。一12个乳腺原代上皮细胞的生长动力学(*第十二届英国石油工程委员会*)和14BPEC（人口翻倍(*PD公司*)vs培养天数）。b条12BPEC在PD8和PD41表达衰老相关β-半乳糖苷酶标记的频率。**c（c）**甲基化平均值*第16页* ^INK4a公司通过焦磷酸测序甲基化分析获得的不同群体加倍的12BPEC中的基因启动子。红色水平线表示*第16页* ^墨水4aM0后人类乳腺上皮细胞的启动子甲基化。d日p16和p53在12BPEC中在停滞前、停滞期和停滞后人群加倍时的表达谱。使用qRT-PCR测试表达，并使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）RNA水平对数据进行标准化

图3
乳腺原代上皮细胞(*BPEC公司*)显示染色体不稳定。一双核BPEC用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，显示：我正常双核细胞；二具有两个微核的双核细胞，三有一个核芽四、带有核质桥。b条在初始、中期和晚期群体倍增（PD）时，12BPEC中每个双核细胞的异常核形态频率。酒吧10微米。**c（c）**12BPEC中期板在PD早期、中期和晚期观察到的不同类型结构染色体畸变的频率d日着丝粒检测到的结构染色体畸变的代表性例子 + 端粒肽核酸（PNA）-荧光就地杂交（FISH）(左边)和M-FISH(*正确的*)探针。**e（电子）**非整倍体的频率（显示12个BPEC在PD早期、中期和晚期的结果）。每列代表来自六条分析染色体（1、4、6、12、17、18）的累积非整倍体频率。如果单核与1号、14号和18号染色体的着丝粒探针杂交的代表性图像。箭头18号染色体的三个拷贝。克四倍体的频率。每个酒吧表示用1、4、6、12、17和18号染色体探针杂交后确定的具有四倍体染色体组的细胞的频率（显示了12个BPEC在PD早期、中期和晚期的结果）。小时四倍体细胞核的代表性图像

图4
乳腺原代上皮细胞的染色体不稳定性(*BPEC公司*)与端粒侵蚀相关。一参与重排的个体染色体的分布与端粒无信号末端的个体染色体轮廓相关(*条形图*对应于PD44的12BPEC）。b条部分中期显示了具有端粒无信号末端的单个染色体的两个代表性示例（每个文件中一个）(左行)以及这些特殊染色体臂参与重排（M荧光就地中间行和端粒杂交 + 着丝粒鱼类右行).c（c）不同染色体端粒无信号末端频率的回归及其与重排的关系(图表对应于PD44的12BPEC）。d日分析了四倍体12BPEC在三个群体加倍（PD）的中期（内重和非内重）的频率，分析了每个供体和PD的100个中期平板。**e（电子）**非内重四倍体BPEC中期代表性图像

图5
人端粒酶逆转录酶的异位表达(小时)拯救乳腺原代上皮细胞染色体不稳定性表型(*BPEC公司*).一04BPEC hTERT和05BPEC hTERT的生长动力学。b条通过qRT-PCR评估12BPEC-hTERT与有限（非随机）BPEC中hTERT的mRNA水平。**c（c）**端粒无信号末端的染色体在与小时（PD25为12BPEC，PD21为12BPEC-hTERT）。d日转导后结构染色体重排频率降低小时（PD25为12BPEC，PD21为12BPEC-hTERT）。**e（电子）**用小时（PD25为12BPEC，PD21为12BPEC-hTERT）

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1. Ince TA、Richardson AL、Bell GW、Saitoh M、Godar S、Karnoub AE等，2007年。不同人类乳腺上皮细胞类型的转化导致不同的肿瘤表型。癌细胞。2007;12(2):160–70. doi:10.1016/j.ccr.2007.06.013。-内政部-公共医学
1. Jemal A、Siegel R、Ward E、Murray T、Xu J、Thun MJ。癌症统计，2007年。癌症临床杂志。2007;57(1):43–66. doi:10.3322/cangclin.57.1.43。-内政部-公共医学
1. Smigal C、Jemal A、Ward E、Cokkinides V、Smith R、Howe HL等。按种族和族裔划分的乳腺癌趋势：2006年更新。癌症临床杂志。2006;56(3):168–83. doi:10.3322/canjclin.56.3.168。-内政部-公共医学
1. Troester MA、Hoadley KA、Sörlie T、Herbert BS、Börresen-Dale AL、Lönning PE等。乳腺癌化疗的细胞型特异性反应。癌症研究2004；64(12):4218–26. doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-0107。-内政部-公共医学
1. Garbe JC、Pepin F、Pelissier FA、Sputova K、Fridriksdottir AJ、Guo DE等。人类乳腺上皮衰老过程中具有基础分化倾向的多能干细胞的积累。《癌症研究》，2012年；72(14):3687–701. doi:10.1158/0008-5472.CAN-12-0157。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[1] Ince TA、Richardson AL、Bell GW、Saitoh M、Godar S、Karnoub AE等，2007年。不同人类乳腺上皮细胞类型的转化导致不同的肿瘤表型。癌细胞。2007;12(2):160–70. doi:10.1016/j.ccr.2007.06.013。-内政部-公共医学

[2] Ince TA、Richardson AL、Bell GW、Saitoh M、Godar S、Karnoub AE等，2007年。不同人类乳腺上皮细胞类型的转化导致不同的肿瘤表型。癌细胞。2007;12(2):160–70. doi:10.1016/j.ccr.2007.06.013。-内政部-公共医学

[3] Jemal A、Siegel R、Ward E、Murray T、Xu J、Thun MJ。癌症统计，2007年。癌症临床杂志。2007;57(1):43–66. doi:10.3322/cangclin.57.1.43。-内政部-公共医学

[4] Jemal A、Siegel R、Ward E、Murray T、Xu J、Thun MJ。癌症统计，2007年。癌症临床杂志。2007;57(1):43–66. doi:10.3322/cangclin.57.1.43。-内政部-公共医学

[5] Smigal C、Jemal A、Ward E、Cokkinides V、Smith R、Howe HL等。按种族和族裔划分的乳腺癌趋势：2006年更新。癌症临床杂志。2006;56(3):168–83. doi:10.3322/canjclin.56.3.168。-内政部-公共医学

[6] Smigal C、Jemal A、Ward E、Cokkinides V、Smith R、Howe HL等。按种族和族裔划分的乳腺癌趋势：2006年更新。癌症临床杂志。2006;56(3):168–83. doi:10.3322/canjclin.56.3.168。-内政部-公共医学

[7] Troester MA、Hoadley KA、Sörlie T、Herbert BS、Börresen-Dale AL、Lönning PE等。乳腺癌化疗的细胞型特异性反应。癌症研究2004；64(12):4218–26. doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-0107。-内政部-公共医学

[8] Troester MA、Hoadley KA、Sörlie T、Herbert BS、Börresen-Dale AL、Lönning PE等。乳腺癌化疗的细胞型特异性反应。癌症研究2004；64(12):4218–26. doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-0107。-内政部-公共医学

[9] Garbe JC、Pepin F、Pelissier FA、Sputova K、Fridriksdottir AJ、Guo DE等。人类乳腺上皮衰老过程中具有基础分化倾向的多能干细胞的积累。《癌症研究》，2012年；72(14):3687–701. doi:10.1158/0008-5472.CAN-12-0157。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Garbe JC、Pepin F、Pelissier FA、Sputova K、Fridriksdottir AJ、Guo DE等。人类乳腺上皮衰老过程中具有基础分化倾向的多能干细胞的积累。《癌症研究》，2012年；72(14):3687–701. doi:10.1158/0008-5472.CAN-12-0157。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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