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.2016年2月；94(2):44.
doi:10.1095/biolreprod.115.133058。 Epub 2016年1月6日。

生长抑制特异性-1（GAS1）是一个C/EBP靶基因，在小鼠排卵和黄体形成中起作用

易安仁 1, 刘志林 1, 丽莎·穆拉尼 1, 陈明凡 2, 乔安妮·理查兹 三
附属公司

生长抑制特异性-1（GAS1）是一个C/EBP靶基因，在小鼠排卵和黄体形成中起作用

易安仁等。 生殖生物学. 2016年2月.

摘要

排卵前卵泡中的排卵和黄体生成是由黄体生成素（LH）激增启动的；然而，在这些卵泡中介导LH作用的信号事件仍不完全明确。LH激增的两个关键转录因子是C/EBPalpha和C/EBPbeta，它们在颗粒细胞中的缺失导致完全不育。对这些突变小鼠的微阵列分析显示，一些基因的表达发生了改变，包括生长抑制特异性-1（Gas1）。为了研究Gas1在排卵和黄体化相关过程中的功能，我们将Cyp19a1-Cre和Gas1（flox/flox）小鼠杂交，有条件地删除颗粒细胞和卵丘细胞中的Gas1。野生型小鼠在人类绒毛膜促性腺激素（hCG）刺激后约12-16小时，颗粒细胞和卵丘细胞中的Gas1表达显著增加，而Cebpa/b双突变体和Gas1突变体小鼠中的这种增加被消除。GAS1也在卵巢基质细胞中动态表达，与C/EBPalpha/beta无关。雌性Gas1突变小鼠具有生育能力，排卵率提高，生育能力增强，颗粒细胞中Areg和Lhcgr mRNA水平升高。这些突变雌鼠的黄体形态和血管化均正常。有趣的是，与hCG后24小时的对照组相比，Gas1突变小鼠黄体中与黄体化相关的许多基因（Cyp11a1、Star、Wnt4、Prlr、Cd52和Sema3a）的mRNA水平降低；这些差异在hCG后48小时不再可检测到。C/EBP靶点Gas1在颗粒细胞中诱导，并与排卵和黄体生成相关。

关键词：C/EBPα；C/EBPβ；气体1；黄体；排卵。

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数字

图1
图1
的表达式气体1排卵前后在颗粒细胞和COC中诱导。mRNA水平气体1颗粒细胞增多(A类)和COC(B类)实时定量PCR检测排卵时。对于两者A类和B类，数据显示平均值±SEM；n=3。没有常见上标的横条在统计上存在差异(P（P）< 0.05).C类)hCG后16小时从输卵管收集的排卵COC中GAS1（绿色）和PTX3（红色）的免疫荧光定位。棒材=100μm。天)排卵前后颗粒细胞、黄体细胞和卵巢基质细胞中GAS1和AKT的Western blot分析。GC，颗粒细胞；CL，黄体。E类)排卵前后卵巢GAS1的免疫荧光染色。棒材=100μm。F类)免疫荧光染色显示，GAS1在排卵前（hCG后3和10小时）的散在颗粒细胞（箭头）中表达，以及GAS1的细胞质膜定位在黄体化颗粒细胞中（h CG后24小时）。CL，黄体。Bar=50和10μm。hCG后24小时，GAS1（绿色）的表达主要与SFRP4（红色）在黄体化颗粒细胞中的表达共定位。CL，黄体；F、 毛囊。
图2
图2
诱导气体1黄体化颗粒细胞的表达依赖于C/EBPα/β。A类)的级别气体1排卵周颗粒细胞（突变小鼠）、黄体化颗粒细胞（野生型）（hCG后24小时）和COC（hCG16小时）的mRNA在Cebpa/b公司飞行/飞行；Cyp19a1-芯与野生型对照组相比，突变小鼠。数据显示平均值±SEM；n=3*P（P）< 0.01.B类)GAS1在野生型对照组CL和排卵前卵泡（POF）中的免疫荧光定位Cebpa/b公司飞行/飞行；Cyp19a1-芯hCG后16小时的突变小鼠。棒材=50μm。C类)GAS1和PECAM-1在卵巢早衰组织中的免疫荧光定位Cebpa/b公司飞行/飞行；Cyp19a1-芯hCG后16小时的突变小鼠。棒材=50μm。天)野生型未成熟未刺激小鼠卵巢中GAS1（绿色）或GAS1和PECAM-1（红色）的IF染色代表性图像。F、 毛囊。Bar=100（左）和40（右）μm。E类)hCG刺激后4小时卵巢中GAS1（绿色）IF染色的代表性图像。F、 毛囊。棒材=200μm。F类)hCG刺激后12小时卵巢中GAS1（绿色）和IV型胶原（红色）的IF染色代表性图像。FCL，形成黄体。Bar=100（左）和60（右）μm。G公司)hCG刺激后72小时卵巢中GAS1的IF染色和自身荧光（绿色，来自类固醇生成细胞）信号的代表性图像。F、 滤泡；CL，黄体。棒材=100μm。
图3
图3
条件性缺失小鼠的产生气体1颗粒细胞和COC中。A类)繁殖计划。B类)PCR扩增气体1野生型、杂合型和纯合型基因气体1hCG后24小时获得的突变颗粒细胞和COC。C类)GAS1在对照组和对照组卵巢中的免疫荧光定位气体1飞行/飞行；塞浦路斯191a CrehCG后24和48小时的突变小鼠。F、 滤泡；CL，黄体。棒材=100μm。天)分离CL中GAS1的Western blot分析气体1飞行/飞行控制和气体1飞行/飞行；Cyp191a-Cre公司突变成年雌性小鼠。每个样本代表从单个小鼠分离的CL。
图4
图4
有条件删除气体1颗粒细胞和COC促进排卵。A类)繁殖试验气体1飞行/飞行；Cyp191a-Cre公司突变小鼠和气体1飞行/飞行控制；n=5。B类)超排卵研究气体1飞行/飞行；Cyp191a-Cre公司突变小鼠和气体1飞行/飞行控制；n=8*P（P）< 0.01.C类)mRNA水平气体1卵巢颗粒细胞中的排卵/黄体生成相关基因气体1飞行/飞行；Cyp191a-Cre公司hCG后5小时的突变小鼠和野生型对照。数据显示平均值±SEM；n=4*P（P）< 0.05.天)用于气体1和COC中的排卵相关基因气体1飞行/飞行；Cyp191a-Cre公司突变小鼠和野生型对照。数据显示平均值±SEM；n=4*P（P）< 0.05.
图5
图5
mRNA水平阿雷格和Lhcgr公司颗粒细胞或气体1飞行/飞行；Cyp191a-Cre公司hCG刺激前突变小鼠与对照组的比较(A类和B类)（eCG后48小时）或排卵后(C类和天)（hCG后16小时）。数据显示平均值±SEM；n=3*P（P）< 0.05.
图6
图6
CL关键基因的mRNA水平在气体1飞行/飞行；Cyp191a-Cre公司与对照组相比，突变小鼠。A类)mRNA水平气体1和整个卵巢中的黄体基因气体1突变小鼠和对照小鼠在hCG后24小时。黄体基因的数据表示为突变株的相对值除以对照组的相对值；n=4*P（P）< 0.05.B类)的信使核糖核酸气体1和卵巢中的黄体基因气体1hCG后24小时突变小鼠和对照小鼠。黄体基因的数据表示为突变体中的相对值除以对照中的相对值；n=5*P（P）< 0.05.C类)体外培养颗粒细胞中Gas1的缺失降低了黄体基因的mRNA水平。Fo/PMA治疗24小时。
图7
图7
GAS1并不直接调节CL的血管发育。A类)血清孕酮水平气体1hCG后24小时突变小鼠和对照小鼠。数据表示平均值±SEM，n=5。B类)卵巢切片上H&E染色的代表性图像气体1hCG后24小时突变小鼠和对照小鼠。棒材=100μm。C类)卵巢切片上GAS1、IV型胶原和PECAM-1的IF染色代表性图像气体1突变和对照小鼠。棒材=100μm。天)野生型卵巢切片上GAS1、IV型胶原和PECAM-1的IF定位代表性图像。棒材=10μm。CL，黄体。
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