Epigenetic regulation of autophagy by the methyltransferase EZH2 through an MTOR-dependent pathway

doi:10.1080/15548627.2015.1117734

.2015;11(12):2309-22.

doi:10.1080/15548627.2015.1117734。

甲基转移酶EZH2通过MTOR依赖性途径对自噬的表观遗传学调控

傅振伟¹, 紫阳曹¹, 西王¹, Hui Wang（王慧）¹, 慕艳才², 李婷婷^三, 直子服部⁴, 王东来¹, 杜一鹏¹, 《伯颜歌》¹, 林林曹¹, 长春申¹, 王丽娜¹, 王海英¹, 杨扬¹, 谢丹², 范旺⁵, Ushijima先生⁴, 赵莹（音）¹, 魏国柱^1 6 7

附属公司

¹致癌与转化研究重点实验室（教育部）；天然药物与仿生药物国家重点实验室；北京市蛋白质翻译后修饰与细胞功能重点实验室；生物化学与分子生物学系；北京大学卫生科学中心；中国北京。
²华南肿瘤国家重点实验室；中山大学肿瘤中心；中国广州。
^三c生物医学信息学系；基础医学院；北京大学卫生科学中心；中国北京。
⁴d表观基因组学分部；国家癌症中心研究所；日本东京。
⁵e放射医学系；基础医学院；北京大学；中华人民共和国北京。
⁶f北京大学-清华大学生命科学中心；中国北京。
⁷g医学院；深圳大学；中国深圳。

PMID： 26735435
预防性维修识别码：项目经理4835210
内政部： 10.1080/15548627.2015.1117734

甲基转移酶EZH2通过MTOR依赖途径对自噬的表观遗传调控

傅振伟等。自噬. 2015.

.2015;11（12）：2309-22。

doi:10.1080/15548627.2015.1117734。

作者

傅振伟¹, 紫阳曹¹, 西王¹, Hui Wang（王慧）¹, 蔡木彦², 李婷婷^三, 直子服部⁴, 王东来¹, 杜一鹏¹, 博扬歌曲¹, 林林曹¹, 长春申¹, 王丽娜¹, 王海英¹, 杨扬¹, 谢丹（Dan Xie）², 范旺⁵, Ushijima先生⁴, 赵莹（音）¹, 魏国柱^1 6 7

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¹致癌与转化研究重点实验室（教育部）；天然药物与仿生药物国家重点实验室；北京市蛋白质翻译后修饰与细胞功能重点实验室；生物化学与分子生物学系；北京大学卫生科学中心；中国北京。
²华南肿瘤国家重点实验室；中山大学癌症中心；中国广州。
^三c生物医学信息学系；基础医学院；北京大学卫生科学中心；中国北京。
⁴d表观基因组学分部；国家癌症中心研究所；日本东京。
⁵e放射医学部；基础医学院；北京大学；中华人民共和国北京。
⁶f北京大学-清华大学生命科学中心；中国北京。
⁷g医学院；深圳大学；中国深圳。

PMID： 26735435
预防性维修识别码：项目经理4835210
内政部： 10.1080/15548627.2015.1117734

摘要

大自噬是一种进化上保守的细胞过程，参与蛋白质和细胞器的清除。尽管自噬调节机制已经被广泛研究，但自噬过程的关键表观遗传学控制仍然未知。在这里，我们报告了甲基转移酶EZH2（zeste 2多梳抑制复合物2亚单位增强子）表观遗传抑制MTOR（雷帕霉素[丝氨酸/苏氨酸激酶]的机械靶点）通路的几个负调控因子，如TSC2、RHOA、DEPTOR、FKBP11、RGS16和GPI。EZH2通过MTA2（转移相关1家族，成员2）招募到这些基因启动子中，MTA2是核小体重塑和组蛋白去乙酰化酶（NuRD）复合物的组成部分。MTA2被鉴定为一种新的染色质结合蛋白，其与染色质的结合促进了EZH2随后的募集，以沉默靶基因，尤其是TSC2。EZH2下调TSC2（结节性硬化症2）可诱导MTOR激活，进而调节随后的MTOR通路相关事件，包括抑制自噬。在人类结直肠癌（CRC）组织中，MTA2和EZH2的表达与TSC2的表达呈负相关，这揭示了表观遗传调控、MTOR途径、自噬诱导和肿瘤发生之间的新联系。

关键词：EZH2；MTA2；MTOR途径；自噬；组蛋白修饰。

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数字

**图1。**
抑制EZH2诱导自噬。(A类)HeLa细胞转染NS（非特异性）或*EZH2型*-用蛋白酶抑制剂（10μM E64和10μM胃蛋白酶抑制素A）特异性siRNA 48小时。用LC3B抗体（绿色）和DAPI对细胞进行染色，并在共聚焦显微镜下观察LC3B斑点。比例尺：10μm。(B类)中每个细胞LC3B点数量的量化A类中的数据B类为平均值±标准差（n=50，重复3次实验）。(**C和D**)HeLa细胞转染NS（非特异性）或*EZH2型*-特异性siRNA(C类)或经GSK126（2μM）处理(D类)在存在或不存在蛋白酶抑制剂（E64和胃蛋白酶抑制素A）的情况下持续48小时。如图所示，提取细胞裂解物并用免疫印迹法进行分析。(E类)将FLAG标记的EZH2或空质粒分别转染到MCF-7细胞中。转染后24h，细胞在含有或不含血清的培养基中培养24h。在存在或不存在溶酶体蛋白酶抑制剂（E64和胃蛋白酶抑制素A）的情况下检测到LC3B-II的积累。(F类)一个标记有旗帜的EZH2^Y641H年将突变体或空质粒分别转染到含有或不含GSK126的MCF-7细胞中。转染后24h，细胞在含有或不含血清的培养基中孵育24h。在存在或不存在溶酶体蛋白酶抑制剂（E64和胃蛋白酶抑制素A）的情况下检测到LC3B-II的积累。

**图2（参见上一页）。**
EZH2通过MTOR途径调节自噬。(A类)标记有FLAG的EZH2（WT）或EZH2^H689A型突变体被单独转染到MCF-7细胞中长达48小时。提取细胞提取物，然后按指示进行免疫印迹分析。(B类)一个标记有旗帜的EZH2^Y641H年突变体或空质粒分别转染MCF-7细胞。在转染后24小时，用或不用GSK126处理细胞48小时。提取细胞提取物，然后按指示进行免疫印迹分析。(C类)一个标记有旗帜的EZH2^Y641H年将突变体或空质粒分别转染到含有或不含GSK126的MCF-7细胞中。转染后24小时，将细胞在含有或不含有血清的培养基中孵育24小时。提取细胞提取物，然后按指示进行免疫印迹分析。(D类)HeLa细胞转染对照组（NS）或2个独立的*EZH2型*-特异性siRNAs。48小时后，进一步转染抗RNAi的拯救形式wt-EZH2以拯救EZH2.的表达。提取细胞裂解液，然后按指示进行免疫印迹分析。(E类)使用或不使用2μM GSK126处理HeLa细胞48小时。如图所示，提取细胞裂解物并用免疫印迹法进行分析。(**F和G**)用一个或多个表达活性（RHEB）的空质粒转染HeLa细胞^Q64L型-FLAG）或非活动（RHEB^D60公里-MYC）RHEB突变体。转染24小时后，用对照（NS）或*EZH2型*-使用或不使用蛋白酶抑制剂（E64和胃蛋白酶抑制素A）的特定siRNA 48小时。如图所示，通过免疫印迹分析细胞提取物(F类). 在共焦显微镜下观察到内源性LC3B点状信号。比例尺：10μm（G）。(**H（H）**)中每个细胞LC3B点数量的量化(克). 中的数据(**H（H）**)为平均值±标准差（n=50，重复3次实验）。

**图3。**
EZH2调节*TSC2系统*和其他与MTOR通路相关的基因。(A类)用2μM GSK126处理HeLa细胞48 h或转染2个独立的*EZH2型*-48小时特异性siRNA。然后提取RNA，并按照指示进行RT-PCR。(B类)将FLAG-EZH2（WT）或空质粒转染MCF-7细胞48小时。然后提取RNA并用RT-PCR进行分析。给出了所示基因的mRNA表达水平。(C类)将FLAG-EZH2（WT）或空质粒转染到MCF-7细胞中48小时。使用所示抗体进行蛋白质印迹。(D类)一个空质粒，一个FLAG-EZH2（WT），一个标记为FLAG-EJH2^H689A型突变体或FLAG-tagged EZH2^Y641H年将突变体转染293T细胞。24小时后，转染EZH2的细胞^Y641H年用GSK126处理48小时。然后使用所示抗体进行蛋白质印迹。(**E和F**)ChIP实验使用抗EZH2和抗H3[K27me3]抗体，结合EZH2(E类)或H3[K27me3](F类)在HCT116细胞中检测到指示启动子。*CCND2型*作为阳性对照。所有误差条表示s.d.（n=3）。

**图4（参见上一页）。**
EZH2的基因特异性招募依赖于MTA2结合。(A类和B类)HCT116细胞核蛋白(A类)或LOVO细胞(B类)用抗EZH2提取并免疫沉淀。用兔IgG免疫沉淀法作为阴性对照。用所示抗体进行免疫印迹。(C类)HCT116细胞转染非特异性siRNA或靶向siRNAMTA2型使用所示抗体进行ChIP分析。测量MTA2、EZH2、H3[K27me3]和H3[K27Ac]在指示启动子上的富集。*CCND2号机组*作为阳性对照。(D类)将FLAG标记的MTA2或空质粒分别转染HCT116细胞。使用所示抗体进行ChIP分析。*CCND2号机组*作为阳性对照。(E类)转染HCT116细胞*MTA2型*siRNA后转染编码siRNA抗性的质粒*MTA2型*按照指示进行蛋白质印迹。(F类)将FLAG标记的EZH2或空质粒分别转染到HCT116细胞中，加入或不加入针对*MTA2型*用所示抗体进行免疫印迹。

**图5。**
抑制MTA2可诱导自噬。(A类)HeLa细胞转染NS（非特异性）或2个独立的*MTA2型*-使用或不使用蛋白酶抑制剂（E64和胃蛋白酶抑制素A）的特定siRNA 48小时。如图所示，提取细胞裂解物并用免疫印迹法进行分析。(B类)将FLAG标记的MTA2或空质粒分别转染293T细胞。转染后24小时，细胞在含有或不含血清的培养基中培养24小时。在存在或不存在溶酶体蛋白酶抑制剂（E64和蛋白胨-A）的情况下检测到LC3B-II的积聚。(C类)将标记有FLAG的EZH2或空质粒分别转染到293T细胞中，并加入或不加入siRNAMTA2型然后将细胞在无血清培养基中培养24小时。在存在或不存在溶酶体蛋白酶抑制剂（E64和胃蛋白酶抑制素A）的情况下检测到LC3B-II的积累。(D类)用A FLAG标记的EZH2或空质粒转染HeLa细胞，有或没有siRNA对抗*MTA2型*然后在含有或不含血清的培养基中用蛋白酶抑制剂（E64和胃蛋白酶抑制素A）培养24小时。然后用LC3B抗体（绿色）、FLAG抗体（红色）和DAPI对细胞进行染色。共聚焦显微镜下观察到LC3B斑点。比例尺：10μm。(E类)量化（D）中每个细胞的LC3B点数量。（E）中的数据为平均值±标准差（n=50，重复3次实验）。

**图6。**
MTA2是一种染色质结合蛋白。(A类)示意图显示了分离不同细胞组分的程序。用抗MTA2免疫印迹法检测各组分的细胞等效量，以检测不同组分中MTA2的富集情况。(B类)用FLAG-MTA2或空质粒转染HCT116细胞。S4部分用抗FLAG抗体免疫沉淀。用所示抗体进行免疫印迹。(C类)分别表达、纯化GST、GST-MTA2和GST-EZH2，并在体外与重组组蛋白八聚体孵育。沉淀的组蛋白用抗H3蛋白进行免疫印迹。(D类)分别表达、纯化GST、GST-MTA2和GST-EZH2，并与生物素标记的组蛋白肽体外孵育。(E类)表达、纯化MTA2的GST融合突变片段，并与生物素标记的组蛋白肽孵育。

**图7（参见上一页）。**
MTA2、EZH2、TSC2和SQSTM1在人CRC标本中的表达水平。(A类)IHC分析显示正常组织中MTA2和EZH2呈阴性表达（左），癌组织中MTA2-EZH2高表达（右）。(B类)IHC分析显示肿瘤细胞中MTA2、EZH2和SQSTM1高表达，TSC2低表达（CRC，病例33）。(C类)另一例CRC（病例165），肿瘤细胞中TSC2高表达，MTA2、EZH2和SQSTM1低表达。(D类)197例CRC患者MTA2和EZH2表达的生存分析。(E类)描述EZH2调节MTOR和自噬的调节机制的假设模型。

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1. 水岛N.蛋白质和器官周转中的自噬。冷泉Harb Symp Quant Biol 2011；76:397-402; PMID:21813637；http://dx.doi.org/10.1101/sqb.2011.76.011023-DOI程序-公共医学
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[1] 自噬：在不到十年的时间里从现象学到分子理解。Nat Rev Mol Cell Biol 2007年；8:931-7; PMID:17712358；http://dx.doi.org/10.1038/nrm2245-DOI程序-公共医学

[2] 自噬：在不到十年的时间里从现象学到分子理解。Nat Rev Mol Cell Biol 2007年；8:931-7; PMID:17712358；http://dx.doi.org/10.1038/nrm2245-DOI程序-公共医学

[3] 水岛N.蛋白质和器官周转中的自噬。冷泉Harb Symp Quant Biol 2011；76:397-402; PMID:21813637；http://dx.doi.org/10.1101/sqb.2011.76.011023-DOI程序-公共医学

[4] 水岛N.蛋白质和器官周转中的自噬。冷泉Harb Symp Quant Biol 2011；76:397-402; PMID:21813637；http://dx.doi.org/10.1101/sqb.2011.76.011023-DOI程序-公共医学

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[9] Noda T，Ohsumi Y.Tor，一种磷脂酰肌醇激酶同源物，控制酵母中的自噬。生物化学杂志1998；273:3963-6; PMID:9461583；http://dx.doi.org/10.1074/jbc.273.7.3963-DOI程序-公共医学

[10] Noda T，Ohsumi Y.Tor，一种磷脂酰肌醇激酶同源物，控制酵母中的自噬。生物化学杂志1998；273:3963-6; PMID:9461583；http://dx.doi.org/10.1074/jbc.273.7.3963-DOI程序-公共医学

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