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.2016年2月；202(2):565-82.
doi:10.1534/genetics.115.183228。 Epub 2015年12月17日。

转座因子1360对果蝇P元件报告子异色结构域的靶向作用

凯瑟琳·侯辛加（Kathryn L Huisinga） 1, 妮可·C·里德尔 2, 梁伟信（Wilson Leung） 三, 沙查尔·西蒙诺维奇 三, 斯蒂芬·麦克丹尼尔 三, 亚历杭德拉·菲格罗亚·克拉夫加 三, 萨拉·C·R·埃尔金 4
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转座因子1360对果蝇P元件报告子异色结构域的靶向作用

凯瑟琳·侯辛加（Kathryn L Huisinga）等。 遗传学. 2016年2月.

摘要

异染色质是真核生物用来组成性沉默转座元件的一种常见DNA包装形式。确定将哪些序列包装为异染色质对生物体至关重要。在这里，我们使用果蝇研究异染色质的形成，利用位置效应杂色，这是一个过程，如果将转基因插入异染色素附近，就会随机沉默，从而产生杂色表型。先前的研究确定转座因子1360是异染色质形成的靶点。我们使用带有一个或四个1360拷贝的转基因报告子来确定增加局部重复密度是否会改变支持异染色质形成的基因组比例。我们发现，在报告人中包含1360个基因会增加观察到各种表型的频率。这种增加是由于端粒相关序列插入的恢复更大（～50%的杂色插入）。与其他地方的杂色插入相比，端粒相关序列插入的表型在很大程度上独立于报告者中1360的存在。我们发现，杂色和完全表达的转基因位于不同类型的染色质中，并且端粒相关序列中的杂色报告基因与着丝粒周围异染色质中的不同。事实上，转基因插入位点的染色质标记可以用来预测眼睛表型。我们的分析表明，增加局部重复密度（通过转基因报告子）并不会增加支持异染色质形成的基因组比例。相反，1360的额外拷贝似乎能更有效地将报告者定位于端粒相关序列，从而增加杂色插入的恢复。

关键词：果蝇；染色质；异染色质；位置效应杂色；可转置元素。

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数字

图1
图1
其他副本1360在中hsp70白色报告者增加了具有杂色眼睛表型的植入物的恢复。（A） 的示意图{T1}页和P{T4}型元素报告员。{T1}页包含的一个副本1360{}1503（黄色方框，尖头表示规范的方向1360ORF），占总施工量的12.5%，位于hsp70白色记者（红色方框），同时P{T4}型包含四份1360{}1503位于相反方向，占总构装的34.1%。侧面的三角形1360序列代表可用于移除1360FLP重组酶的元件。弯曲箭头指示hsp70白色转基因，转基因两端的哈希框代表P（P）-换位所需的元素结束。（B） 图表总结了从A中所示的报告结构的动员中恢复的蝇类的眼睛表型；那些具有纯色眼睛表型（红色和NRS）的人用纯色红色表示，那些具有杂色眼睛表型的人用斑点红色表示。注意，与表1相反，这些数字不包括在F2中不产生后代的系。左侧：{T1}页。右侧：P{T4}型.
图2
图2
附加1360在记者中复制P（P）元素导致插入基因组亚中心区（TAS）和中心周围区域的株系频率增加。地图D.黑腹果蝇显示插入位点位置的基因组。顶部地图显示{T1}页插入位点；底部显示P{T4}型插入位点。三角形的颜色对应于飞线的眼睛颜色（参见图底部的键）。组蛋白基因簇中的插入物位于完整重复序列簇的5′端(即，2L:21421980-21425660），尽管不知道它们位于哪个重复拷贝中。中心粒被描绘成灰色圆圈。眼睛图像包括选定数量的线条。{T1}页插入用“9M1”前缀标记，而P{T4}型插入件具有“9M4”前缀。
图3
图3
染色体2R和3R的亚端粒区域中的所有插入位点都聚集在TAS串联内部重复序列中。ClustalW（汤普森等。1994）染色体2R TAS_1.001kb、染色体3R TAS_984bp、侵略者4 LTR_346bp和HetRP DM_1.872kb卫星序列的比对，显示了P（P）-TAS中的元素插入位点。{T1}页元素以橙色/红色显示，并且P{T4}型元素以蓝色/绿色显示，第一种颜色表示第2染色体上的报告子，第二种颜色表示3染色体上的记录子。X-TAS 1.8-kb重复序列的内部173/173/161bp串联重复序列由蓝色实线表示。请注意，所有插入位点都在这些重复中。阴影方框标记插入部分，其中PEV在删除1360元素。对齐背景颜色反映了序列保护的级别：黄色-所有四个序列都是相同的；橄榄-三个序列是相同的；和紫色-两个序列是相同的。
图4
图4
的移除1360大约三分之一的记者被记者压制了PEV，但在TAS可以增强PEV。（A） 比较三个表型类别中报告系分数的条形图[{T1}页或P{T4}型有杂色（PEV）、非红色固体（NRS）或红色眼睛（红色）]，在切除1360碎片。（B） 杂色插入线样品的图像和定量色素分析数据，说明去除后PEV抑制（眼睛色素水平增加）1360插入物的细胞学位置显示在括号中，每个插入位点的确切染色体位置可以在表S3眼睛色素水平以OD报告480(年-轴）分别用于雄性和雌性，有和没有1360(x个-轴）。误差条是标准误差(n个= 4). （C） 去除后PEV增强的选定杂色插入线的图像和定量色素分析数据1360有关详细信息，请参见B。有无眼线的眼部色素水平1360雄性的所有品系都有显著差异，但只有雌性的9M4-340品系有显著差异(P（P）< 0.05,t吨-测试）。
图5
图5
TAS插入位于不同于着丝粒周围异染色质的染色质环境中。热图显示了在围绕染色质标记的1-kb窗口内，选定染色质标记富集水平的层次聚类P（P）-测试抑制杂色的所有杂色报告线的元素插入位置1360切除（面板1：红色的丰富阴影；蓝色的耗尽阴影）。右侧的附加面板显示了在插入位点的1kb窗口内转座元件的平均重复密度（面板2：较深的阴影表示较高的密度）、平均小RNA密度（面板3：较深的阴影表示较高的密度）和TSS的平均数量（面板4：较深的阴影表示较高的数量）。染色体2R和3R TAS将簇插入一起，显示出相同的缺乏影响1360切除（不抑制杂色）。根据所检查的染色质标记，中心周围插入物不分为受影响组和未受影响组。图S8显示了使用大量ChIP数据集的类似分析。染色质来源如下：S2、BG3、KC细胞系；EE-2至4小时胚胎；LE-14至16小时胚胎；L—三龄幼虫；和H-fly头。聚类图上方的颜色：红色表示异染色质相关标记，绿色表示活性转录相关标记，棕色表示Polycomb公司系统。
图6
图6
染色质标记、重复密度和小RNA图谱将杂色插入物与具有实心红眼表型的插入物区分开来。（A） 基因组区域2L:～19800000–21500000的屏幕截图，显示了BG3细胞中选择性活性组蛋白修饰（绿色：H3K4me2，H3K23ac）和抑制性组蛋白修饰和HP1a的富集水平。该区域的报告插入位点标记如下（红色眼睛；蓝色眼睛），以及基因和TE。BG3细胞染色质状态使用哈尔琴科的颜色方案显示在底部轨道上等。(2010). 使用Repbase（Jurka 2000）鉴定了TEs（DNA TEs和反转录转座子）。这个x个-轴：碱基对中的位置。（B） 如A，但区域2R：～1800000–2650000。（C） K-表示对每个报告元件插入位点周围的20kb窗口使用modENCODE富集数据的聚类结果。我们选择了五个簇，因为这样可以在不同眼睛表型（红色）的品系之间进行最佳分离与。杂色）而不将每个表型分成亚簇。红眼表型在簇1“常染色质”和簇2中占主导地位，簇2缺乏大多数检测标记。簇4“着丝粒周围和第四染色体异染色质”中以杂色眼表型为主；簇3，染色体3R TAS；和簇5，染色体2R TAS。右侧的其他面板显示了每个眼睛表型类别中每个簇的百分比、每个染色体上插入的数量、每个染色质状态中插入的数量（Kharchenko等。2010年），TSS的平均数量，TEs的平均密度，以及插入位点20-kb窗口内的平均小RNA密度。图中还显示了位于piRNA簇内的簇内插入物的百分比（Brennecke等。2007). 请参见图S9用于显示每个插入站点的结果的版本。聚类图下方的颜色：红色表示异染色质相关标记，绿色表示活性转录相关标记，棕色表示Polycomb系统相关标记。每个簇中红色（红色）、杂色（蓝色）和NRS插入线（橙色）的数量显示在热图的右侧。
图7
图7
随机森林集合分类器可用于识别区分具有红眼表型的插入系和具有杂色眼表型的插入系的重要因素。（A） 使用邻近矩阵的MDS图对Random Forest分类器进行评估，显示出两个不同的簇，对应于红色和杂色眼睛表型。然而，NRS线分散在MDS图中。MDS图结果与Random Forest算法生成的混淆矩阵一致，该矩阵显示NRS线（0.71）的分类误差比红色线（0.04）或杂色线（0.06）高得多。（B） Random Forest分类器可用于解释表型类别（20-kb窗口）之间染色质标记富集水平的大多数变化，袋外错误率估计为11.35%。可变重要性点图显示了前30个染色体蛋白质和组蛋白修饰(年-轴）对眼睛表型分类最为重要（以基尼平均值下降衡量；x个-轴）。眼睛表型分类的最重要变量是H3K9me3、HP1a和H3K23ac。
图8
图8
{T1}页和P｛T4｝杂色报告基因被插入到重复序列密度相近的基因组区域，而大多数红色报告基因位于重复序列密度较低的区域。方框图的显示约定：方框表示四分位范围（IQR；Q1–Q3）。方框内的线表示中间值。晶须分别对应于Q1−1.5×IQR和Q3+1.5×IWR。胡须外的点表示异常值。（A） 方框图显示了所有转基因插入位点周围20-kb窗口中按重复类型分离的总重复密度和重复密度。请参见图S5用于1、5和10-kb窗口比较。（A和B）显示了每个报告类别的单独方框图({T1}页或P{T4}型具有非红色纯色眼睛、红色眼睛或杂色眼睛颜色的线条。对于“总重复密度”、“简单重复密度”，“TAS/卫星密度”和“DNA TE密度”，眼睛颜色不同的线与眼睛颜色为红色和NRS的线在这两个方面都有显著差异{T1}页和P{T4}型行(P（P）<0.05，Kruskal–Wallis试验）。对于“反转录转座子密度”{T1}页眼睛颜色为红色和杂色的线条之间存在显著差异(P（P）<0.05，Kruskal–Wallis检验），而这些比较对于P{T4}型线。这个{T1}页和P｛T4｝记者对环境的反应类似；这些记者在任何类别中都没有发现显著差异(P（P）>0.05，Kruskal–Wallis试验）。（B） 方框图显示TAS外所有插入位点的TE密度。最左边的图显示了总TE密度，而其他图显示了细分为子类别的重复密度（DNA转座子、反转录转座子，LINE元件和LTR元件）。使用了一个20 kb的窗口。对于{T1}页在“TE密度”、“反转录转座子密度”、”LINE TE密度”和“LTR TE密度”方面，具有杂色眼色的品系与红色和NRS眼色品系之间存在显著差异，而只有杂色和红眼色品线之间的“DNA TE密度”差异显著(P（P）<0.05，Kruskal–Wallis试验）。对于P{T4}型在“TE密度”和“DNA TE密度”方面，具有杂色眼色的线与红色和NRS眼色线显著不同，而只有具有杂色和红色眼色线之间的比较在“DNA TE浓度”、“LINE TE密度”以及“LTR TE密度”上显著不同(P（P）<0.05，Kruskal–Wallis试验）。
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