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.2016年1月19日；7(3):3144-57.
doi:10.18632/目标6551。

新型PAD4/SOX4/PU.1信号通路参与急性早幼粒细胞白血病细胞定向分化为粒细胞

宋冠华 1, 露露石 1, 郭玉琦（Yuqi Guo） 1, 余林昌 1, 王林（Lin Wang） 2, 张晓宇 1, 李连连 1, 杨翰 1, 夏仁 1, Qiang Guo（强国） 1, 科宏毕 三, 江国胜 1
附属机构

新型PAD4/SOX4/PU.1信号通路参与急性早幼粒细胞白血病细胞定向分化为粒细胞

宋冠华等。 Oncotarget公司. .

摘要

全反式维甲酸（ATRA）治疗通过蛋白酶体降解PML-RARα融合蛋白（通常促进急性早幼粒细胞白血病（APL）），治愈率>80%。然而，最近的证据表明，ATRA也可以促进PML-RARα阴性的白血病细胞的分化，如HL-60细胞。本文利用HL-60细胞的基因表达谱来研究APL分化受损的替代机制。编码PAD4的肽酰精氨酸脱氨酶4（PADI4）的表达在ATRA诱导的分化过程中恢复，PAD4是一种翻译后将精氨酸转化为瓜氨酸的蛋白质。我们进一步确定PADI4启动子的超甲基化与其在HL-60和NB4（PML-RARα阳性）细胞中的转录抑制相关。在功能上，PAD4在ATRA暴露后易位到细胞核，并促进ATRA介导的分化。利用RNAi敲除或电穿孔介导的PADI4递送以及染色质免疫沉淀进行的机制研究有助于确定PU.1为PAD4调节的间接靶点，SOX4为直接靶点。事实上，PAD4以SOX4依赖的方式调节SOX4介导的PU.1表达，从而调节分化过程。总之，我们的结果强调了PAD4和APL中DNA超甲基化之间的联系，并证明靶向PAD4或调节其下游效应器可能是控制临床分化的一种有希望的策略。

关键词：PADI4；区别；白血病；甲基化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。白血病细胞分化过程中PAD4表达增加
（A）ATRA处理后HL-60细胞的形态学变化。（B）从微阵列数据中，聚类热图显示了ATRA诱导分化前后HL-60中mRNA的不同表达(P（P）<0.05).（C）在不同时间点ATRA（1μM）处理HL-60细胞后，检测到PAD4在mRNA（顶部）和蛋白质（底部）水平的表达。GAPDH被用于归一化作为负荷控制。（D）用qRT-PCR（左）和Western blot（右）检测DMSO处理72 h后HL-60细胞中PAD4的表达。（E）采用qRT-PCR和Western blot检测ATRA作用72h后NB4细胞中PAD4 mRNA（左）和蛋白（右）水平的表达。（F）采用Western blot检测ATRA治疗后临床标本中PAD4的表达。（G）qRT-PCR检测APL临床标本中PAD4的表达(n个=12）和正常控制(n个= 8). *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. 数据是生物三倍体的平均值（±标准误差）和代表性的三倍体实验。
图2
图2。PADI4型启动子在ATRA诱导分化过程中经历去甲基化
（A）1.0 mM DAC治疗72 h或200 nM TSA治疗24 h前后HL-60（左）和NB4（右）细胞中PAD4 mRNA（顶部）和蛋白（底部）水平的表达。（B）应用MSP检测甲基化状态PADI4型在ATRA诱导分化的指定时间点，HL-60（顶部）和NB4（底部）中的启动子。通道M中的PCR带表明甲基化PADI4型基因；车道U中的带表示未甲基化PADI4型基因。（C）DAC处理72小时后PADI4型通过MSP测定。（D）相对甲基化水平PADI4型启动子区用MeDIP-qPCR分析。（E）进行ChIP分析以确定DNMT1在PADI4型启动子。在免疫沉淀前取预先清除的裂解液（1%）作为输入对照。*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. 数据是生物三倍体的平均值（±标准误差），所有数据都代表了三倍体实验。
图3
图3。PAD4促进白血病细胞分化，ATRA治疗促进其细胞核移位
（A）在没有或存在ATRA暴露的情况下，通过Western blot验证靶向PAD4的siRNA转染效率。（B）HL-60细胞沉默后的分化B1–B6层流式细胞术检测B7–B12或过表达。FCM还检测了PAD4抑制剂Cl-脒对HL-60细胞分化的影响B13–B16. *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. 数据是生物三倍体的平均值（±标准误差）。(C类)经不同时间ATRA处理后，Western blot检测PAD4在蛋白水平上在细胞质（左）和细胞核（右）的表达。Tubulin和Lamin B分别作为负荷控制。（D）采用免疫荧光法检测ATRA治疗前后HL-60中PAD4免疫染色（绿色显示）。所有数据都是三次重复实验的代表。
图4
图4。PAD4在分化过程中间接调节PU.1
（A）和（B）在ATRA诱导分化过程中，通过Western blot检测沉默PAD4A或其抑制剂Cl-amidine B对PU.1表达的影响。（C–E）电穿孔诱导HL-60中PAD4过度表达后，用qRT-PCR和Western blot检测PAD4和PU.1的表达。（F）不同区域（1-12）SPI1号机组描述了启动子。（G）ChIP-qPCR检测PAD4与SPI1号机组ChIP分析中的启动子。13表示阳性对照，为已知的PAD4结合位点第21页.14表示IgG为阴性对照。*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. 数据代表了三次重复实验。
图5
图5。SOX4介导PAD4对PU.1的调节
（A–C）电穿孔介导SOX4以逐渐增加的方式过度表达36 h后，采用qRT-PCR和Western blot检测HL-60细胞中SOX4和PU.1的表达。（D）siRNA-介导的SOX4敲除HL-60细胞中PU.1的表达。（E）SOX4绑定到SPI1号机组用ChIP分析启动子。（F）在指定的治疗后测定SOX4的表达，并应用GAPDH作为负荷对照。(G公司)启动子区示意图SOX4系统P1–P6代表SOX4系统如上图所示的启动子。（H）pGL3-基本控制或各种SOX4系统将构建物和PADI4质粒共同转染到HEK293细胞中。转染24小时后，收集细胞进行荧光素酶报告试验。（一）应用ChIP-qPCR检测PADI4在SOX4系统启动子。在用抗PADI4抗体进行ChIP后，用引物在不同位置进行PCRSOX4系统启动子被执行。一、 II、III、IV和V代表不同颜色的不同引物扩增区域，如图所示（H）. *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. 数据是生物三倍体的平均值（±标准误差）和代表性的三倍体实验。
图6
图6。PAD4通过瓜氨酸化调节SOX4的表达，并以SOX4依赖的方式发挥作用
（A–C）应用ChIP分析检测PAD4、H3Cit和H3R17me与SOX4系统启动子对ATRA诱导的粒细胞分化的影响。阳性对照代表已知的抗H3R17Me阳性和抗H3cit阳性区域第21页启动子。阴性对照为IgG。(D–F）在存在靶向PAD4的siRNA的情况下，同样的试验也用于检测上述参数。（G）和（H）HL-60在指定治疗后分化的FCM分析。电穿孔诱导PAD4或SOX4异位表达。（一）电穿孔诱导添加外源性PAD4、SOX4或两者后HL-60细胞中PAD4、SOX4和PU.1蛋白表达的蛋白质印迹分析。(J–L）进行qRT-PCR分析以量化PADI4型,SOX4系统、和SPI1号机组APL临床样本中(n个= 12). 之间的相关性PADI4型和SOX4系统J.、。，PADI4型和SPI1号机组英国，以及SOX4系统和SPI1号机组通过皮尔逊相关分析。*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. 数据是生物三倍体的平均值（±标准误差）。所有分析均使用至少三种独立的制剂进行，并一式三份进行测量。
图7
图7。PAD4在APL细胞异常分化中作用的假设模型
脱甲基PADI4型在ATRA诱导的分化过程中，其表达同时恢复。此外，ATRA刺激促进了PAD4的核移位，而PAD4反过来又可以促进ATRA存在下APL细胞的分化。从机制上讲，PAD4可以通过瓜氨酸化组蛋白3直接调节SOX4的表达，从而拮抗H3Arg17的甲基化。此外，PU.1被证实为SOX4的直接靶点，PAD4可以促进分化或以SOX4依赖的方式调节PU.1的表达，提示在APL的病理机制中PAD4、SOX4和PU.1之间可能形成功能通路。
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