EP400 Deposits H3.3 into Promoters and Enhancers during Gene Activation

doi:10.1016/j.molcel.2015.10.039

.2016年1月7日；61(1):27-38.

doi:10.1016/j.molcel.2015.10.039。 Epub 2015年12月6日。

在基因激活期间，EP400将H3.3沉积到启动子和增强子中

苏曼·普拉丹¹, 特伦特·苏¹, 林达·燕², 卡琳·雅克^三, 黄成阳¹, 雅克·科特^三, Siavash K库尔德斯坦⁴, 迈克尔·F·凯里⁵

附属公司

¹加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院生物化学系，351A生物医学研究大楼，615 Charles E.Young Drive South，Los Angeles，CA 90095-1737，USA。
²加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所，Paul D.Boyer Hall，611 Charles E.Young Drive South，Los Angeles，CA 90095-1570，美国。
^三拉瓦尔大学癌症研究中心，CHU de Que bec Research Center-Oncology，Hótel-Dieu de Que bec，9 McMahon Street，Quebec City，QC G1R 2J6，Canada。
⁴加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院生物化学系，351A生物医学科学研究大楼，615 Charles E.Young Drive South，Los Angeles，CA 90095-1737，USA；加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所，Paul D.Boyer Hall，611 Charles E.Young Drive South，Los Angeles，CA 90095-1570，USA。
⁵加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院生物化学系，351A生物医学科学研究大楼，615 Charles E.Young Drive South，Los Angeles，CA 90095-1737，USA；加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所，Paul D.Boyer Hall，611 Charles E.Young Drive South，Los Angeles，CA 90095-1570，USA。电子地址：mcarey@mednet.ucla.edu。

PMID： 26669263
预防性维修识别码：项目经理4707986
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2015.10.039

在基因激活期间，EP400将H3.3沉积到启动子和增强子中

苏曼·普拉丹等。摩尔细胞. 2016.

.2016年1月7日；61(1):27-38.

doi:10.1016/j.molcel.2015.10.039。 Epub 2015年12月6日。

作者

苏曼·普拉丹¹, 特伦特·苏¹, 林达·燕², 卡琳·雅克^三, 黄成阳¹, 雅克·科特^三, Siavash K库尔德斯坦⁴, 迈克尔·F·凯里⁵

附属公司

¹加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院生物化学系，351A生物医学研究大楼，615 Charles E.Young Drive South，Los Angeles，CA 90095-1737，USA。
²加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所，Paul D.Boyer Hall，611 Charles E.Young Drive South，Los Angeles，CA 90095-1570，USA。
^三拉瓦尔大学癌症研究中心，CHU de Que bec Research Center-Oncology，Hótel-Dieu de Que bec，9 McMahon Street，Quebec City，QC G1R 2J6，Canada。
⁴加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院生物化学系，351A生物医学科学研究大楼，615 Charles E.Young Drive South，Los Angeles，CA 90095-1737，美国；加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所，Paul D.Boyer Hall，611 Charles E.Young Drive South，Los Angeles，CA 90095-1570，USA。
⁵加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院生物化学系，351A生物医学科学研究大楼，615 Charles E.Young Drive South，Los Angeles，CA 90095-1737，USA；加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所，Paul D.Boyer Hall，611 Charles E.Young Drive South，Los Angeles，CA 90095-1570，USA。电子地址：mcarey@mednet.ucla.edu。

PMID： 26669263
预防性维修识别码：项目经理4707986
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2015.10.039

摘要

后生动物中的基因激活伴随着组蛋白变体H2AZ和H3.3在启动子和增强子中的出现。然而，目前尚不清楚是什么蛋白质将H3.3沉积到染色质中，也不知道变异染色质是否在基因激活中发挥直接作用。这里我们显示，含有乙酰化H2AZ和H3.3的染色质在体外刺激转录。对固定化染色质模板上的Pol II预引发复合物的分析表明，E1A结合蛋白p400（EP400）优先与乙酰化双变异染色质结合，并需要乙酰化双变染色质进行转录刺激。EP400还刺激H2AZ/H3.3沉积到启动子和增强子中，并在介体复合物下游一步影响体内转录。EP400在体外以染色质和ATP刺激的方式分别与H2AZ和H3.3有效交换重组组蛋白H2A和H3.1。我们的数据显示，EP400将H3.3与H2AZ一起沉积到染色质中，并在PIC组装后参与基因调控。

关键词：EP400；H2AZ；H3.3；RNA聚合酶Ⅱ；组蛋白交换；预引发复合物（PIC）。

PubMed免责声明

数字

**图1。变异染色质以EP400依赖方式体外刺激转录**
（A）体外转录。如图所示，末端生物素化G5E4T使用标准、单或双变异八聚体组装成染色质，并固定在顺磁性小球上。如图所示，染色质由Gcn5和Esa1（HAT）乙酰化，并与HeLa核提取物+/−GAL4-VP16（活化剂）中的核苷酸（NTP）孵育。显示引物延伸凝胶的磷光体图像，并使用3个重复的平均/SD光谱单位进行绘图。通过Student t检验，双星号表示p值<0.01；n.s.不重要。（B） PIC的固定模板（IT）捕获。固定化的典型或双变异染色质如（A）减去NTP。纯化的PIC用指示蛋白的抗体进行免疫印迹。（C）乙酰化典型或双变异染色质（B）免疫印迹中选择蛋白质的定量。（D）使用pan-H3Ac抗体测量典型和双变异染色质的H3乙酰化水平：B（结合）和S（上清液/洗涤）组分。（E）模拟（M）和EP400缺失（EP400Δ）提取物在9倍滴定范围内的EP400免疫印迹。（F）对Mock和EP400Δ提取物中的选定PIC成分进行IT分析。（G） EP400制剂的银染凝胶。（H） Mock或EP400Δ提取物中乙酰化染色质的体外转录。如图（A）所示，3个重复，但+/-重组EP400如图所示。学生的t检验p值<0.01，用**表示。

**图2。EP400是基于模型细胞的报告系统中转录所必需的**
（A） U2OS Tet-On VP16报告系统示意图。（B）在指定时间点（Dox诱导后小时：h.p.i）对未经处理、模拟和EP400 siRNA-KD细胞（KD）中的F-Luc逆转录酶-PCR产物进行定量。（C）在指定时间点用VP16、Pol II、MED1（介体）、EP400和H3.3抗体对启动子进行ChIP-qPCR。条形图表示相对于输入DNA在时间点的富集。（D）通过GAPDH水平标准化的模拟与siRNA KD的EP400免疫印迹。（E）交联染色质部分或全细胞提取物的H2AZ、H3.3、H3和H4免疫印迹分析。数字表示模拟（M）中归一化为1的KD信号强度；显示了具有代表性的斑点。（F） Dox后Mock与EP400 KD细胞Pol II、Mediator和H3.3的ChIP。学生的t检验p值<0.01为**；不显著用n.s表示。

**图3。EP400和启动子变异染色质的全基因组分析**
（A） U2OS启动子（3kb侧翼TSS）处EP400、Pol II、介体（MED26）、H3.3和H2AZ的热图。富集的P值由EP400绘制并排序。mRNA热图绘制了模拟的FPKM和对数的折叠变化（FC）₂KD/Mock FPKM（绿色下调，红色上调，黑色不变）。Wilcoxon秩和差异的P值为9E-19。（B）代表性基因组浏览器视图。（C）通过基因表达聚类的（A）的元基因分析。彩色线条表示顶部（红色；C1）、中部（绿色；C2）和底部（紫色；C3）的每个蛋白质富集10%的表达基因；黑线（C4）是所有基因的平均值。（D）（A）中ChIP实验的EP400 KD富集倍数变化在EP400结合基因启动子上以显著峰值（TSS±3kb）绘制为log2（KD/Mock）。绿色表示指示蛋白质的结合减少。总H3（H3）ChIP数据添加到此图中，但未显示在对数的A（E）箱线图中₂M和KD条件下H3.3、总H3、H2AZ、Pol II和MED26 ChIP信号的泊松p值。显示了Wilcoxon秩和检验的误差。

**图4。EP400对变异染色质基因表达的敲除分析**
（A） EP400 KD与Mock中差异表达基因的文氏图。前9964个基因的RNA（按>1 FPKM值）分析，变化≥1.5倍。在EP400 KD条件下，4024个下调（绿色），2086个上调（红色）。（B）用对数表示M和KD条件下FPKM下调（绿色）和上调（红色）基因的箱线图₂比例尺。（C）热图显示了FPKM在M和KD中下调（绿色）和上调（红色）的基因，并根据折叠变化进行了排序，以确保清晰。（D）按类别对受影响基因进行基因本体分析。使用Benjamini校正对多假设检验的P值进行校正。

**图5。EP400敲除对增强剂占用率和基因表达的影响分析**
（A） KD和/或Mock细胞中活性远端基因间U2OS增强子处H3K4me1、H3K18ac、EP400、H3.3、H2AZ和Pol II的热图（距离H3K4me1峰中心的−/+5 kb）。通过H3K4me1和H3K18ac标记对活性增强子进行评分，不包括TSS上游+3 kb或TTS下游，并通过在Mock和EP400 siRNA KD细胞中富集H3K4me1进行分类。（B）假定增强器的浏览器轨迹。显示与活性增强子一致的标记的标记用轨迹下方的箭头表示，即Pol II、Mediator、EP400、H3.3、H2AZ、H3K18ac和H3K4me1的可识别峰值。（C）如图3D所示，所有EP400结合增强子中H3.3、H2AZ和Pol II的富集倍数变化均为显著峰值，按H3K4me1丰度排序。H3.3和H2AZ变化的Wilcoxon秩和p值均<2E-308（饱和），Pol II为2E-148。（D）对数的箱线图₂具有p值的前10%增强子在M和KD条件下的H3.3、H2AZ和Pol II泊松p值。（E）通过GREAT分析得出的最近邻效应。按照H3K4me1富集度排序，绘制了Top、Middle和Bottom 10%假定增强子的最近增强子近端基因的平均FPKM。

**图6。EP400体外组蛋白交换**
300 ng固定化典型染色质与Apyrase处理的EP400和300 ng H3.3-H4四聚体或H2AZ-H2B二聚体+/-1 mM ATP孵育。捕获、清洗染色质并进行H2AZ（A）或H3（B）免疫印迹。FLAG-H3.3通过流动性与H3.1区分，并使用泛H3抗体检测；H2B作为对照。（C）或者，150 ng固定化裸DNA或300 ng标准染色质与EP400和300 ng组蛋白变体八聚体孵育，并对H3.3进行FLAG免疫印迹。（A–C）的图表示≥3个独立实验。（D）和（E）的输入和条件如上所述。（D） I.显示H2AZ交换成珠状结合的H2A染色质；二、。显示了H2A沉积到H2AZ染色质中的反向反应。（E） ●●●●。I.显示H3.3交换为H3.1染色质；二、。显示H3.1沉积到H3.3染色质中的反向反应；三、显示His-H3.3交换为Flag-H3.3染色质。

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