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.2015年12月21日；211(6):1177-92.
doi:10.1083/jcb.201501089。 Epub 2015年12月14日。

肌动蛋白结合蛋白EPS8结合VE-粘附素并调节YAP定位和信号传导

科斯坦扎·贾皮埃罗 1, 安德烈亚·迪桑扎 2, 卢卡·布拉维 2, 米里亚姆·巴里奥斯·罗迪尔斯 三, 莫妮卡·科拉达 2, 伊曼纽拉·弗里托利 2, 塞西莉亚·萨沃拉尼 2, 玛丽亚·格拉齐亚·兰普格纳尼 4, 芭芭拉·博格蒂 5, 卡琳·尼森 5, 杰夫·勒瓦纳（Jeff L Wrana） 6, 乔治·西塔 7, 伊丽莎白·德贾纳 8
附属公司

肌动蛋白结合蛋白EPS8结合VE-粘附素并调节YAP定位和信号传导

科斯坦扎·贾皮埃罗等。 J细胞生物学. .

摘要

血管内皮（VE）钙粘蛋白传递有助于血管止血的细胞内信号。通过VE钙粘蛋白发出信号需要不同细胞内伴侣的结合和活性。Yes-associated protein（YAP）/TAZ转录辅因子是细胞生长和器官大小的重要调节因子。我们表明，EPS8是调节肌动蛋白动力学的信号适配器，是VE粘附素的新伴侣，能够调节YAP活性。通过生物化学和成像方法，我们证明EPS8与重塑连接的VE-cadherin复合体相关，促进YAP易位到细胞核和转录激活。相反，在稳定连接中，14-3-3-YAP与VE-cadherin复合物相关，而Eps8除外。在Eps8-null小鼠体内外，YAP的结合抑制核移位并使其转录活性失活。Eps8的缺失也会增加体内血管的通透性，但不会导致其他主要血管缺陷。总之，我们鉴定了粘附连接复合体的新成分，并介绍了VE-cadherin复合体控制YAP转录活性的新分子机制。

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数字

图1。
图1。
EPS8是内皮细胞中AJ复合物的一种新成分。（A） LUMIER检测全长VE-cadherin–EPS8相互作用（上图）；这些数据代表了五个独立的实验。EPS8与全长VE-cadherin的关联（下图）。VE-cadherin阳性内皮细胞提取物中内源性VE-cadherin和EPS8的免疫共沉淀和Western blot。虚线表示LIR为3，这是一个保守的LIR截止值。（B） 通过His-tag下拉分析体外VE-cadherin胞质尾部和EPS8全长相互作用（左）。通过GST下拉试验分析VE-cadherin细胞质尾部与EPS8缺失突变体（星号）之间的体外相互作用（右）。（C） COS-1细胞瞬时表达后EPS8与VE-cadherin全长（VE-cad）、Δ-p120和Δ-βcat突变体的关联。用指示的构建物转染细胞，用特异性EPS8抗体或同种对照IgG免疫沉淀，并按指示进行印迹。（D） 融合早期（24小时）条件下VE-cadherin阳性内皮细胞的IF显微镜检查。细胞用抗VE粘附素（红色）和抗EPS8（绿色）抗体双重染色。检测到连接EPS8与VE-cadherin共定位（箭头）。虚线轮廓表示右侧的放大区域。（E） 汇流条件不同阶段EPS8表达水平的WB分析（左）（见材料和方法部分）。Vinculin是加载控制。融合条件下不同阶段WT肺衍生内皮细胞的IF显微镜（右）。Eps8的IF−内皮细胞证实了染色的特异性。细胞用抗EPS8抗体（绿色）和DAPI（蓝色）染色。棒材：（D和E）20µm；（放大倍数）10µm。IVB，体外结合；TOT，总细胞裂解物。
图2。
图2。
EPS8表达对AJ组织和动力学的影响。（A） 中EPS8重建的WB（左）和qRT-PCR（右）分析第8版−/−肺源性内皮细胞。细胞感染WT EPS8-GFP（EPS8+)或控制GFP（EPS8−)慢病毒载体。基因表达水平已表示为三个独立实验的折叠变化±SEM。（B） EPS8中VE-cadherin（P=0.06）和β-catenin（P=0.07）的qRT-PCR分析+和EPS8−EC。对于每个测试基因，表达水平表示为四个独立实验的折叠变化±SEM。（C） EPS8提取物中VE-cadherin和β-catenin表达的WB分析（左）+和EPS8−EC处于汇合状态。文丘林显示为加载控件。图（右）表示WB量化。柱是三个独立实验的平均值±SEM。虚线表示Eps8的相对水平+细胞设置为1。（D） 汇合EPS8的IF显微镜+和EPS8−用抗VE-cadherin和β-catenin抗体染色的细胞。在没有EPS8的情况下，可以观察到连接蛋白的分布增加。棒材，20µm。（E） 来自EPS8的VE-cadherin IP+和EPS8−细胞提取物，然后进行丝氨酸665残基磷酸化和泛素水平的WB分析（顶部）。三个独立实验的定量显示为底部的平均值±SD。*，P<0.05；**，P<0.01。
图3。
图3。
YAP在体外定位于长汇合单层的连接处，在体内定位于更稳定的血管中。（A，顶部）在不同汇合状态阶段，用共焦显微镜分析野生型肺源性内皮细胞中YAP（红色）与VE-cadherin（绿色）和细胞核（DAPI，蓝色）的共定位（见材料和方法部分中的细胞系）。棒材，20µm。（A，底部）呈现VE-cadherin和YAP共定位的像素以白色突出显示。棒材，10µm。细胞核用箭头高亮显示，连接用箭头高亮显示。（B） 图中显示了YAP和DAPI（顶部）或VE-cadherin（底部）之间共定位像素数的量化。数据是三个独立实验的平均值±SEM。*，P<0.05；**，P<0.01。（C） P9小鼠不同器官中Pecam-1（红色）和YAP（绿色）定位的共焦显微镜分析（上图）。棒材，50µm。呈现Pecam-1和YAP共定位的像素以白色突出显示。量化YAP和Pecam-1（底部）之间的共定域像素数。数据为所分析五只小鼠的平均值±SEM。*，视网膜、肾脏、肝脏和脾脏与大脑的比较P<0.05。
图4。
图4。
EPS8表达调节融合内皮细胞中YAP磷酸化、定位和转录活性。（A） 汇合EPS8中的YAP磷酸化（磷酸-YAP丝氨酸127）+和EPS8−细胞。用WB分析总细胞裂解物的磷酸化和用特异性抗体分析总YAP的表达。（B，左）融合EPS8中YAP核质分布的WB分析+和EPS8−细胞。去除EPS8后（右），YAP从优先核定位转移到优先细胞质定位。NP-95和微管蛋白分别用作核和细胞质标记物。右边的图表表示四个独立实验的量化。（C） EPS8中YAP（红色）核定位（箭头）的IF显微镜+和EPS8−EC。棒材，20µm。（D） qRT-PCR分析结缔组织生长因子(细胞生长因子),富含半胱氨酸的血管生成诱导剂61(Cyr61型)、和抑制素βA(英赫巴)在EPS8中+和EPS8−ECs来测量YAP转录活性。EPS8的缺失强烈抑制了YAP的转录活性。对于每个测试基因，表达水平表示为三个独立实验的折叠变化±SEM。**，P<0.01。
图5。
图5。
YAP磷酸化和转录活性通过不同的PI（3）K–Akt通路激活和与α-连环蛋白的结合来调节。（A） 抑制PI（3）K-Akt途径后YAP和Akt磷酸化的WB分析。细胞生长到90%的汇合处，饥饿24小时，并在含有PI（3）K抑制剂LY294002（10µM）的完整培养基中培养过夜。文丘林显示为加载控件。（B） qRT-PCR分析气缸61,细胞生长因子、和英赫巴在EPS8中抑制PI（3）K后测量YAP转录活性+和EPS8−EC。（C） EPS8中过表达组成活性Akt（myr-Akt）后YAP磷酸化的WB分析+和EPS8−EC。文丘林显示为加载控件。（D） qRT-PCR分析气缸61,细胞生长因子、和英赫巴测量EPS8中myr-Akt表达的YAP转录活性+和EPS8−EC。（E） EPS8中YAP–α-catenin复合物的免疫共沉淀和WB分析+和EPS8−EC。（F） VE-cadherin的IP和EPS8中细胞-细胞接触处YAP–α-catenin复合物定位的WB分析+和EPS8−细胞对α-连环蛋白特异性siRNA的依赖。（G） EPS8中α-catenin特异siRNA上YAP磷酸化的WB分析+和EPS8−EC。Vinculin显示为一种负载控制。（H） qRT-PCR分析细胞生长因子,气缸61、和英赫巴测量α-catenin siRNA的YAP转录活性。对于每个测试的基因，表达水平表示为三个独立实验的倍数变化±SEM。*，P<0.05；**，P<0.01。TOT，总细胞裂解物。
图6。
图6。
EPS8和14–3-3–YAP复合物竞争与α-catenin的结合。（A） VE-cadherin阳性细胞提取物中YAP或EPS8的IP，然后进行α-catenin、14-3-3和VE-cadherin相关性的WB分析。EPS8和YAP–14–3-3相互排他性地与VE-cadherin和α-catenin结合。（B） 通过GST下拉试验分析α-catenin与EPS8-缺失突变体（星号）之间的体外相互作用。（C） EPS8和14-3-3与α-catenin结合的体外竞争试验。在没有EPS8的情况下，14-3-3结合的α-catenin和EPS8以剂量依赖的方式减少了这种直接相互作用。虚线表示污点已修剪。IVB，体外结合；TOT，总细胞裂解物。
图7。
图7。
EPS8的缺失导致早期接触抑制细胞生长并损害EC通透性。（A） WB分析WT肺衍生内皮细胞在不同汇流条件下的磷脂酶-YAP、YAP、磷脂酶-Akt和Akt。Vinculin是加载控制。（B） 不同汇合状态下WT肺源性EC中YAP靶基因的qRT-PCR分析。数据是四个独立实验的平均值±SEM。（C） 对EPS8进行细胞密度分析+和EPS8−EC。在第1天播种等量的细胞，然后在设定的时间点进行计数。在没有EPS8的情况下，VE-cadherin定位更高，因此，细胞-细胞接触抑制增殖增加。数据是八个独立实验的平均值±SEM。（D） 细胞旁示踪通量分析。测定FITC-右旋糖酐（70 kD）的渗透性。数据是三个独立实验的平均值±SEM。60分钟后的所有时间值，Eps8+EC在统计学上低于Eps8−欧共体*，P<0.05；**，P<0.01。
图8。
图8。
EPS8对YAP磷酸化和转录活性的调节独立于其肌动蛋白帽和捆绑功能。（A） EPS8中YAP磷酸化的WB分析+，EPS8−和EPS8ΔB+C EC。文丘林显示为加载控件。（B） qRT-PCR分析细胞生长因子,61号气缸，和英英巴汇流EPS8中+，EPS8−和EPS8ΔB+C电池。只有在EPS8中检测到YAP转录活性的显著差异−EC。对于每个测试基因，表达水平表示为三个独立实验的折叠变化±SEM。*，P<0.05；**，P<0.01。（C） YAP磷酸化、定位和转录活性调控的建议模型。EPS8在连接重构a）期间短暂结合VE-cadherin，而YAP定位于内皮细胞的细胞核；b） 当连接稳定时，VE-cadherin聚集诱导PI（3）K–Akt–YAP磷酸化，因此，YAP被隔离在质膜上。a） Eps8与α-catenin的瞬间直接键阻止了14-3-3-磷酸化YAP的瞬时直接键。
图9。
图9。
EPS8表达调节体内YAP定位和转录活性。（A） WT和WT脑石蜡切片中YAP（白色）和VE-卡德林（红色）定位的共焦显微镜分析第8版-P9小鼠无效。棒材：（A）50µm；（放大倍数）20µm。虚线轮廓表示下面放大的区域。（B） 量化YAP核定位的主要强度。数据为六个WT和六个WTS的平均值±SEM第8版-对空白小鼠进行分析。（C） qRT-PCR分析细胞生长因子和气缸61从WT和第8版-使鼠标无效。数据为五个WT和五个WTS的平均值±SEM电子产品8-分析了无效小鼠。的级别细胞生长因子和气缸61表达式已规范化为VE-卡德林基因表达。*，P<0.05；**，P<0.01。
图10。
图10。
EPS8的缺失改变了AJ组织，并损害了对体内通透性的正确控制。（A） WT和WT患者脑冷冻切片中VE-cadherin（绿色）定位的共焦显微镜分析第8版-空白成年（2月龄）小鼠（左）。VE-cadherin主要表达强度的量化；数据是四个WT和四个WTS的平均值±SEM第8版-对空白小鼠进行分析。棒材：（A）50µm；（放大倍数）20µm。虚线轮廓表示右侧放大的区域。（B） 体内渗透性测定。向小鼠注射25 mg/kg尸体碱–Alexa Fluor 555，2小时后处死小鼠并收集其器官。对整个大脑和肺部进行拍照，并对尸体进行量化。棒材，500µm。器官中尸体的存在以任意单位表示为平均荧光。n个=WT和第8版无效的。虚线轮廓突出了大脑区域。*，P<0.05。
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