Leukotriene C4 is the major trigger of stress-induced oxidative DNA damage

doi:10.1038/ncomms10112

.2015年12月11日6:10112。

doi:10.1038/ncomms10112。

白三烯C4是应激诱导DNA氧化损伤的主要触发因素

埃弗拉特·德瓦什¹, 米查尔·哈·塔尔¹, 萨拉·巴拉克¹, 奥菲尔·迈尔¹, 梅纳赫姆·鲁宾斯坦¹

附属公司

PMID： 26656251
预防性维修识别码：项目经理4682057
内政部： 10.1038/ncomms10112

白三烯C4是应激诱导DNA氧化损伤的主要触发因素

伊夫拉·德瓦什等。国家公社. 2015.

.2015年12月11日6:10112。

doi:10.1038/ncomms10112。

作者

伊夫拉·德瓦什¹, 米查尔·哈·塔尔¹, 萨拉·巴拉克¹, 奥菲尔·迈尔¹, 梅纳赫姆·鲁宾斯坦¹

附属

¹以色列Rehovot 7610001 Weizmann科学研究所分子遗传学系。

PMID： 26656251
预防性维修识别码：项目经理4682057
内政部： 10.1038/ncomms10112

摘要

内质网应激和主要化疗药物通过产生活性氧物种（ROS）破坏DNA。在这里，我们发现内质网应激和化疗通过转录上调和激活非造血谱系细胞中的微粒体谷胱甘肽-S-转移酶2（MGST2）来诱导白三烯C4（LTC4）的生物合成。内质网应激和化疗也会触发两个LTC4受体的核移位。LTC4以脑内方式作用，然后引发NADPH氧化酶4（NOX4）的核移位、ROS积累和DNA氧化损伤。Mgst2缺乏、RNAi和LTC4受体拮抗剂可在体外和小鼠肾脏中消除内质网应激和化疗诱导的活性氧和氧化DNA损伤。细胞死亡和小鼠发病率也显著降低。因此，MGST2产生的LTC4是ER应激和化疗引发的氧化应激和DNA氧化损伤的主要介质。LTC4抑制剂通常用于哮喘，可广泛用于与内质网应激激活NOX4相关的主要人类病理学。

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数字

**图1。内质网应激触发LTC相关蛋白的表达和核定位₄生物合成。**
(一)用BfA诱导内质网应激后不同时间WISH细胞中表达的蛋白质的免疫印迹。印迹是三个重复的代表。(b条–**e（电子）**)用载体或BfA.Trans处理WISH细胞后，对所示蛋白进行免疫染色。是透射光显微镜。细胞核用Hoechst 33258进行复染。所示为5-LO和MGST2的合并；5-LO、Hoechst和cPLA2；Hoechst、5-LO和FLAP；MGST2和ER标记蛋白二硫键异构酶（PDI）。棒材，5 微米。(**（f）**)通过共焦显微镜图像分析确定，利用5-LO量化FLAP和MGST2共定位的百分比。n个=6,*P（P）*两对均<0.0001。(克)通过对面板所示图像的共焦显微镜分析确定的指示蛋白质的核定位百分比的量化b条–**e（电子）**.n个≥6,*P（P）*<0.0001适用于所有样品。中的值**（f）**和克表示平均值±标准差。使用单因素方差分析（ANOVA）确定统计显著性。

**图2。内质网应激触发基于MGST2的LTC生物合成₄.**
(一,b条)LTC免疫染色₄WISH细胞经载体或BfA处理后，相对荧光强度为R.F。酒吧，20 微米。n个=3, ****P（P）*<0.001。(**c（c）**)转染siControl或si后WISH细胞提取物中MGST2的免疫印迹*管理层2*. (d日,**e（电子）**)LTC免疫染色₄用对照siRNA转染WISH细胞或*管理2*siRNA，后跟vehicle或BfA.Bar，100 微米。n个＝3****P（P）*<0.001。中的值b条和**e（电子）**表示平均值±标准差。使用单因素方差分析确定统计显著性。

**图3。内质网应激触发LTC的表达和核定位₄受体。**
(一)两个LTC的免疫印迹₄BfA诱导内质网应激后不同时间WISH细胞中表达的受体CysLTR1和CysLTR2。(b条)用载体或BfA治疗后CysLTR1和CysLTR2的免疫染色。显示PDI与CysLTRI或CysLTR2合并。酒吧，5 微米。(**c（c）**)LTC核定位百分比的量化₄通过分析面板上显示的共焦显微镜图像确定的受体b条.n个所有样品≥6，*P（P）*<0.0001，对于CysLTR2和*P（P）*CysLTR1小于0.02。数值代表平均值±标准差。使用单向方差分析确定统计显著性。(d日)表示内质网应激触发的易位事件的方案，该易位事件启动LTC₄生物合成并与其内在受体结合。

**图4。ER应力生成LTC₄触发NOX4介导的ROS在WISH细胞中的积累。**
(一,b条)在转染对照siRNA或*管理2*siRNA，然后用载体或BfA.Bar处理，100 微米。n个=4, ***P（P）*<0.01. (**c（c）**,d日)在没有或存在LTC的情况下，用载体或BfA处理的细胞中的ROS检测₄受体拮抗剂或MRP1转运体抑制剂逆转。用reversan或受体拮抗剂单独治疗不会诱导ROS。酒吧，100 微米。n个=4, **P（P）*<0.02****P（P）*<0.001。(**e（电子）**,**（f）**)用对照siRNA或*第4个*siRNA，然后用载体或BfA.Bar处理，100 微米。n个=5, ****P（P）*<0.001。(克)用对照siRNA转染的细胞提取物中NOX4的免疫印迹或*第4个*siRNA，然后用载体或BfA处理(小时)用载体或BfA处理的细胞中NOX4的免疫染色。显示Hoechst和NOX4合并。酒吧，5 微米。(我)通过共聚焦图像分析确定NOX4的核定位百分比，如**e（电子）**.n个＝8****P（P）*<0.0001. (j)用所示LTC处理的细胞提取物中NOX4和NOX2的免疫印迹₄受体拮抗剂和载体（−）或BfA（+）。斑点克和j是三个复制品的代表。中的值b条,d日,**（f）**和我表示平均值±标准差。使用单因素方差分析确定统计显著性。

**图5。MGST2-LTC₄该途径触发DNA氧化损伤。**
(一,b条)用载体或BfA处理的细胞中氧化DNA损伤标记物8-OHdG的免疫染色，在没有或存在普鲁司特（pra.）的情况下。酒吧，20 微米。n个=3, ****P（P）*<0.0001. (**c（c）**,d日)在没有或存在BAY u9773的情况下，用载体或BfA处理的细胞中对dsDNA断裂标记物γ-H2AX进行免疫染色。酒吧，20 微米。n个=3, ***P（P）*<0.005. 中的值b条和d日表示平均值±标准差。使用单因素方差分析确定统计显著性。

**图6。MGST2-LTC₄该途径引发内质网应激引发的细胞死亡。**
存活率通过结晶紫染色确定，并与载体处理的细胞相关。(一,b条)转染所示siRNA、用BfA（0.5）处理的WISH细胞的存活率微克毫升⁻¹, 24 h）。酒吧，100 微米。n个＝3***P（P）*<0.02. (**c（c）**)处理后的WISH细胞提取物中MGST2的免疫印迹一. (d日,**e（电子）**)BfA和普鲁司特处理的WISH细胞存活率。棒材，200 微米。n个＝3****P（P）*<0.001。(**（f）**,克)经BfA（1.3）处理的人类HaCaT前角朊细胞的存活率微克毫升⁻¹, 48 h）和海湾u9773（80 nM）。酒吧，100 微米。n个=4, ****P（P）*<0.0001. (小时,我)BfA处理的WISH细胞存活率（48 h）和BAY cysLT2。酒吧，500 微米。n个=4, ****P（P）*<0.001。(j,k个)蛋白酶体抑制剂MG262处理的HaCaT前角朊细胞的存活率（0.05 μM）和零中子。酒吧，50 微米。n个=4, ****P（P）*<0.001。(我,米)经Tm、thapsigargin（Tg）或BfA（1.3）处理的B16细胞的存活率微克毫升⁻¹)和CysLTR1拮抗剂MK571。棒材，200 微米。n个=4, ****P（P）*<0.001。(n个)用BfA（1.3）处理的B16细胞培养基中坏死标记HMGB1的免疫印迹微克毫升⁻¹)和MK571（MK）。Ponceau S染色作为负荷控制。(o个)Tm（2）处理的WISH细胞提取物中裂解caspase-3的免疫印迹微克毫升⁻¹, 48 h）和指示的抑制剂。(第页,问)LTC治疗B16细胞的存活率₄.棒材，200 微米。n个=3, ****P（P）*<0.001。(第页)LTC治疗B16细胞的存活率₄或有限公司₄.棒材，200 微米。(秒,t吨)稳定转染Tet诱导型HEK 293T细胞的存活*管理2*表达载体，用强力霉素处理（2 微克毫升⁻¹, 48 h）。棒材，200 微米。n个＝3****P（P）*<0.001。免疫印迹**c（c）**,n个和o个是三个复制品的代表。中的值b条,**e（电子）**,克,我,k个,米,问和t吨表示平均值±标准差。使用单因素方差分析确定统计显著性。

**图7。*管理2*缺乏可减轻内质网应激引发的氧化应激、DNA损伤和凋亡。**
(一)扩增WT末端和纯合子DNA获得的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳*管理2*-缺陷（KO）小鼠。还显示了杂合子ES细胞（ES）和阴性PCR对照（阴性）的DNA。426 bp的带与来自*管理2*基因。805 bp的带对应于突变的等位基因。(b条,**c（c）**)LTC免疫染色₄WT和*管理2*-BfA.Bar处理后第2代MEF缺陷，20 微米。n个=3, ****P（P）*<0.0001. (d日)WT和WT中NOX4的免疫染色*管理2*-通道2处有缺陷的MEF，用车辆或Tm（4 微克毫升⁻¹, 24 h）。酒吧，20 微米。这张图片是五个复制品的代表。(**e（电子）**,**（f）**)使用DCFH-DA在主WT和*管理2*-缺陷（KO）MEF，用载体或BfA（0.25 微克毫升⁻¹). 酒吧，20 微米。n个=4, ****P（P）*<0.001。(克,小时)8-OHdG在原发性WT和*管理2*-缺陷MEF，用载体或BfA.Bar处理，20 微米。n个=3, ****P（P）*<0.001。(我)WT和*管理层2*-用Tm（3）治疗原发性MEF缺陷微克毫升⁻¹). (j)WT和*管理2*-用载体或Tm（2）处理的初级MEF缺陷微克毫升⁻¹)然后用结晶紫染色。酒吧，50 微米。(k个)MEF中性红染色测定的相对存活率，按j.n个=3, ***P（P）=*0.005. 图像一和我是至少三个重复的代表。中的值**c（c）**,**（f）**,小时和k个表示平均值±标准差。使用单因素方差分析确定统计显著性。

**图8。*管理2*缺陷和LTC₄抑制可减轻内质网应激引起的小鼠肾脏氧化损伤和小鼠发病率。**
(一)WT和WT的血红素-曙红染色肾切片*管理2*-给予单一剂量Tm（1.5 毫克公斤⁻¹，ip），时间=0。在第4天取出肾脏并进行处理。这张图片代表了每组5只小鼠的10个肾脏。棒材，200 微米。(b条)肾近端小管受损的空泡面积百分比的量化一.n个=5, ****P（P）*<0.001。数值代表平均值±标准差。使用单向方差分析确定统计显著性。未经治疗的小鼠肾脏中未观察到空泡。(**c（c）**)使用抗氨肽酶A对WT和WT肾脏切片中的近端小管（棕色）进行免疫组织化学染色*管理层2*-Tm治疗的缺陷小鼠一用苏木精（灰蓝色）对细胞核进行复染。酒吧，50 微米。(d日)肾脏切片中标记物的免疫组织化学染色**c（c）**图为三只小鼠肾脏的代表性。棒材，50 微米。(**e（电子）**)WT和*管理2*-给予Tm（2.5）的129/Sv缺陷小鼠（每组20只）毫克公斤⁻¹，ip），时间=0。*P（P）*=0.0393. (**（f）**)给予Tm（1.5）的WT 129/Sv小鼠（每组10只）的存活率毫克公斤⁻¹，ip）在时间=0时，以及车辆或普拉卢卡斯特（ip，1）的日常管理毫克公斤⁻¹，垂直箭头）。*P（P）*=0.0009. 统计显著性在**e（电子）**和**（f）**使用Gehan–Breslow–Wilcoxon检验。

**图9。化疗激活的MGST2-LTC₄该途径触发NOX4介导的氧化DNA损伤和细胞死亡。**
(一)用阿霉素（5）处理的WISH细胞提取物中指示蛋白的免疫印迹 μM）或5-FU（20 微克毫升⁻¹)在指定的时间内。(b条)用载体或阿霉素（Doxo，5）处理的WISH细胞中5-LO和MGST2的免疫染色 μM）。用Hoechst对细胞核进行复染。事务处理。是透射光显微镜。除透射光显微镜外，所有图像通道均被合并。酒吧，5 微米。(**c（c）**,d日)LTC免疫染色₄在WISH细胞中预先用载体、siControl或si处理*管理2*其次是赋形剂或阿霉素（1 微米，36 h）。用Hoechst对细胞核进行复染。酒吧，20 微米。n个=3, *****P（P）*<0.0001, ****P（P）*<0.001。(**e（电子）**,**（f）**)用载体或阿霉素处理的细胞中NOX4的免疫染色。酒吧，20 微米。n个＝3****P（P）*<0.001。(克,小时)用DCFH-DA检测经载体或阿霉素（2.5 微米，48 h）在没有或存在指示抑制剂的情况下。酒吧，50 微米。n个=6, ****P（P）*<0.0001. (我,j)阿霉素（5）处理的细胞中dsDNA断裂标记γ-H2AX的免疫染色微米，48 h）在指定LTC缺席或在场的情况下₄受体拮抗剂。酒吧，20 微米。n个=3–4****P（P）*<0.0001. (k个,我)主要WT和*管理2*-MEF缺陷，用载体或阿霉素治疗（10 μM），然后用结晶紫染色。酒吧，50 微米。车辆处理WT和KO MEF的存活率分别为100%。n个=3, ****P（P）*<0.005. 图像一和b条是三个复制品的代表。中的值d日,**（f）**,小时,j和我表示平均值±标准差。使用单因素方差分析确定统计显著性。

**图10。*管理2*缺陷和LTC₄抑制减弱5-FU触发的DNA损伤和毒性。**
(一)WT和*管理2*-给予5-FU（300）的缺陷小鼠（每组10只）毫克公斤⁻¹，ip），时间=0。*P（P）*=0.0085. (b条)用5-FU治疗的WT 129/Sv小鼠（每组18只）的存活率一车辆或普拉卢卡斯特（1 毫克公斤⁻¹)在第0、1、2、5、6和7天给药。*P（P）*=0.032。统计显著性在一和b条使用Gehan–Breslow–Wilcoxon检验。(**c（c）**)5-FU（300）处理的WT小鼠肾切片中指示蛋白质和8-OHdG的血红素-伊红（H&E）染色和免疫染色毫克公斤⁻¹，ip at time=0），然后五次服用PBS或普拉卢卡斯特（Pran.，3 毫克公斤⁻¹，ip）如中所示b条第13天处理肾脏。酒吧，50 微米。插图：显示免疫染色细胞核的放大图像。肾脏切片的图像是每组三只小鼠切片的代表。(d日)硼替佐米单独或与指定的LTC联合治疗U266骨髓瘤细胞的存活率₄抑制剂（10 μM）。n个=3. (**e（电子）**)阿霉素联合指定的LTC治疗CCRF-CEM T细胞白血病淋巴母细胞的存活率₄抑制剂（10 μM）。n个=3.在载体和任何抑制剂之间均未发现显著差异d日和**e（电子）**使用单因素方差分析确定统计显著性。

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中的注释

一种令人惊讶的DNA氧化损伤介质。
Dvash E、Rubinstein M。 Dvash E等人。细胞周期。2016;15(7):869-70. doi:10.1080/15384101.2016.1144989。Epub 2016年2月18日。细胞周期。2016 PMID：26890977 免费PMC文章。没有可用的摘要。

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1. Dufey E.、Sepülveda D.、Rojas-Rivera D.和Hetz C.内质网应激信号在健康和疾病中的细胞机制。1.概述。美国生理学杂志。细胞生理学。307，C582–C594（2014）。-公共医学
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[7] Dufey E.、Sepülveda D.、Rojas-Rivera D.和Hetz C.内质网应激信号在健康和疾病中的细胞机制。1.概述。美国生理学杂志。细胞生理学。307，C582–C594（2014）。-公共医学

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[9] Valko M.等人，《正常生理功能和人类疾病中的自由基和抗氧化剂》。国际生物化学杂志。细胞生物学。39, 44–84 (2007).-公共医学

[10] Valko M.等人，《正常生理功能和人类疾病中的自由基和抗氧化剂》。国际生物化学杂志。细胞生物学。39, 44–84 (2007).-公共医学

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