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.2015年12月8日；10（12）：e0143849。
doi:10.1371/journal.pone.0143849。 2015年电子收集。

用于肾组织工程的人胚胎干细胞肾分化天然支架

辛西娅·巴奇尔德 1, 米歇尔·马丁内斯 1, 爱丽丝·F·塔兰塔尔 1 2 三
附属公司

用于肾组织工程的人胚胎干细胞肾分化天然支架

辛西娅·巴奇尔德等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

尽管人们对移植用功能性肾组织的生物工程充满热情，但在临床上实现这项技术的潜力之前，仍存在许多障碍。肾脏可行的组织工程策略需要确定必要的细胞群、有效的支架和3D培养条件，以发展和支持这个重要器官的独特结构和生理功能。我们之前的研究表明，所有年龄组恒河猴肾脏的脱细胞切片提供了一种具有足够结构特性的天然细胞外基质（ECM），对人类胚胎干细胞（hESC）的迁移和分化具有空间和组织影响。为了进一步探索脱细胞天然肾支架在肾组织工程中的应用，将多功能性人胚胎干细胞种植在肾细胞外基质的整体或切片上，并将细胞迁移和表型与已建立的人胚干细胞分化试验进行比较。qPCR和免疫组织化学分析结果表明，当人胚胎干细胞在无细胞因子或生长因子刺激的脱细胞支架中培养时，肾谱系标记物上调，表明细胞外基质在指导肾谱系分化中起作用。人胚胎干细胞还与生长因子进行了分化，并将其接种在肾细胞外基质或新型生物惰性多糖支架上进行进一步成熟。随着时间的推移，两种支架上的肾谱系标记逐渐上调，并且hESC表达肾祖细胞、近端小管、内皮细胞和集合管群的特征基因。这些发现表明，与胚胎体培养相比，天然支架增强了肾谱系标记物的表达。这些研究的结果表明，一种新型多糖支架有助于确定从人胚胎干细胞分化肾祖细胞的方案，并促进组织工程作为功能性肾组织来源的前景。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：作者没有相互竞争的利益。AFT持有Molecular Matrix，Inc的股份；这并没有改变作者对PLOSONE数据和材料共享政策的遵守。

数字

图1
图1。脱细胞肾支架的生产。
之前的全肾支架(A类)以及之后(B)灌注1%十二烷基硫酸钠。全肾灌注后比较同一供者的肾脏(C类)或静态段(D类)去细胞方法。去细胞全肾的组织学比较(E类)带有天然肾脏(F类)显示在保持天然肾结构的情况下去除细胞内容物。在4°C条件下，无搅拌的段脱细胞过程(G公司)当切片在室温下脱细胞过程中放置在摇壶上时，得到了极大的改善(H（H）). 比例尺=100μm。
图2
图2。人胚胎干细胞移植肾支架的再细胞化。
(A类)定制设计的灌注生物反应器示意图，用于通过肾动脉（RA）或输尿管（U）进行细胞接种。(B)培养7天后，肾脏重新细胞化。通过肾动脉植入细胞(C-D公司)或输尿管(E-F公司)在髓质血管或肾小管管腔中观察到，但在皮质外小管或肾小球中没有观察到。随着培养时间的延长，观察到细胞再分化增强(G-H公司)尤其是在髓质区。显示了至少三个独立实验的代表性图像。髓质（M）、皮质（Cx）、比例尺=100μM。
图3
图3。肾脏ECM上调肾脏发育标志物。
人胚胎干细胞分化为类胚体(A类)或在整个肾脏中培养(B)或肾脏切片(C类)在髓质和髓质射线中观察到典型的细胞。(D-F公司)与胚胎体分化相比，肾发育标记物WT1和PAX2在去细胞肾的整个或部分中上调。(G-I公司)AQP1是近端小管的标记物，在类胚体和肾脏切片中的小管样结构中表达，但在整个肾脏中不表达。(J-L公司)波形蛋白是一种间充质和系膜标记物，在所有培养条件下都能表达。其他成熟肾细胞类型的标记物，包括SMA（系膜和血管平滑肌标记物）和Calbindin（肾远端小管）均未表达。用DAPI（蓝色）显示细胞核；比例尺=100μm。
图4
图4。早期肾谱系基因被肾脏ECM上调。
在分化为胚状体或肾支架的人胚胎干细胞中，中胚层（BRY）、后原始条纹（OSR1）、中间中胚层（PAX2）和后肾间充质（WT1）基因的相对表达。平均值±平均值标准误差（SEM）；N≥3次重复。
图5
图5。hESC在肾脏ECM或PSS上的肾定向分化。
（A-D）。用两种生长因子方案（A或B）培养20天后细胞支架构建体的H&E染色。(E-H公司). 存在管状结构，CK阳性，VIM阴性。(I-L）。根据方案A，PAX2阳性区域（中间中胚层和诱导后肾间质）与WT1阳性区域（诱导间质）通常不同。根据方案B，这些标记物在整个构建物中以更弥漫的模式表达。方案B中肾ECM的管状结构为WT1阳性，并被一圈PAX2阳性细胞包围。(M-P公司). 根据方案A和PSS，近端小管标记AQP1的表达频率更高，而Henle环标记UMOD很少在任何构建物中表达。(Q-T（质量-温度）). 远端小管/集合管标记物ECAD在所有结构的上皮细胞上广泛表达，而Henle上升环和集合管标记CALB仅在带有PSS的方案A下的结构中表达。(U-X型). 近端小管标记物EMA在内皮标记物CD31阳性的所有小血管样结构的一些小管结构上表达。用DAPI（蓝色）观察细胞核。显示的代表性图像；N≥3个实验。比例尺=100μm。
图6
图6。在A方案培养的人胚胎干细胞分化中早期肾谱系标记物的表达。
如图所示，将多功能hESC接种在悬浮培养物中，以形成带有补充生长因子的类胚体。使用0天未分化细胞作为对照，计算与看家基因EF1α相关的基因表达（qPCR）。悬浮培养12天后，收集胚状体并将其置于基础培养基中的空气-介质界面的肾ECM或PSS上（箭头所示）。这两种支架在上调肾系基因（N≥3个重复）方面均等于或优于胚胎体培养。除SIX2外，PSS在支持肾前体人群方面与肾ECM相等（OSR1）或更高（BRACHY、LIM1、WT1、PAX2）。
图7
图7。在B方案培养的人胚胎干细胞分化中早期肾谱系标记物的表达。
如图所示，多能性hESC在悬浮培养物中分化为具有补充生长因子的类胚体。5天后，在基础培养基中的空气-介质界面将细胞镀在肾ECM或PSS上（箭头所示）。使用0天未分化的细胞作为比较物（N≥3次重复）计算与看家基因EF1α相关的基因表达（qPCR）。两种支架在引导中间中胚层（OSR1、LIM1、PAX2）和后肾间充质基因WT1的上调方面均优于胚状体培养。肾脏ECM在BRY和SIX2的表达上与胚状体培养相似，而这些基因在PSS上上调。
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