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.2015年12月7日；10（12）：e0144273。
doi:10.1371/journal.pone.0144273。 2015年电子收集。

线粒体-tRNA修饰酶GTPBP3的缺陷表达触发AMPK介导的适应性反应，涉及复合物I组装因子、解偶联蛋白2和线粒体丙酮酸载体

安娜·马丁内斯·萨莫拉 1, 萨尔瓦多·梅塞盖尔 1, 胡安·M·埃斯特夫 2, 马格达·维拉罗亚 1, 卡门·阿瓜多 2 三, 安东尼奥·恩里奎斯 4 5, 埃尔文·克内赫特 2 三, M-Eugenia Armengod公司 1 三
附属公司

线粒体tRNA修饰酶GTPBP3的缺陷表达触发AMPK介导的涉及复合物I组装因子、解偶联蛋白2和线粒体丙酮酸盐载体的适应性反应

安娜·马丁内斯·萨莫拉等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

GTPBP3是一种进化保守蛋白，可能参与线粒体tRNA（mt-tRNA）修饰。在人类中，GTPBP3突变导致肥厚型心肌病伴乳酸酸中毒，并与线粒体翻译缺陷相关，但其发病机制尚不清楚。在这里，我们使用GTPBP3稳定生长模型（shGTPBP3-细胞）进一步表征GTPBP3.缺陷所赋予的表型。我们的实验首次表明，GTPBP3缺失与mt-tRNA低修饰状态有关，因为shGTPBP2细胞的mt-tRNA比对照细胞的tRNA更容易被血管生成素消化。尽管GTPBP3的稳定沉默对线粒体整体翻译的影响相当轻微，但复合物I的稳态水平和活性以及细胞ATP水平是对照组的50%。值得注意的是，在缺乏GTPBP3的细胞中，复合物V的ATP酶活性增加了约40%，这表明线粒体消耗ATP来维持膜电位。此外，shGTPBP3细胞的抗氧化能力增强，解偶联蛋白UCP2水平增加近2倍。我们的数据表明，GTPBP3的稳定沉默触发了AMPK依赖的逆行信号通路，该通路下调NDUFAF3和NDUFAF 4复合物I组装因子和线粒体丙酮酸载体（MPC）的表达，同时上调UCP2的表达。我们还发现参与糖酵解和脂肪酸氧化的基因上调。这些数据与一个模型相一致，在该模型中，高UCP2水平以及MPC下调导致的丙酮酸转运减少，促进了从丙酮酸到脂肪酸氧化的转变，以及糖酵解和氧化磷酸化的解偶联。这些代谢变化和低ATP水平可能会对心脏功能产生负面影响。

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数字

图1
图1。的表达式GTPBP3号机组在shGTPBP3细胞中下调。
（A）qRT-PCR分析GTPBP3号机组shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和阴性对照（NC）细胞中的mRNA表达。（B）使用孔蛋白作为负荷控制，对shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC细胞中的GTPBP3蛋白进行Western blot分析。分子质量标记的位置（以kDa为单位）显示在左侧。箭头表示非特定带区。（C）GTPBP3蛋白的密度分析归一化为负荷控制，并表示为NC的%。在A和C中，至少三个独立生物复制的平均值±SEM。与NC值的差异在***p<0.001时具有统计学意义。A.U.：任意单位。
图2
图2。mt-tRNA的血管生成素消化模式改变赖氨酸和mt-tRNA亮氨酸（UUR）从shGTPBP3细胞中纯化。
（A）mt-tRNA的Northern分析赖氨酸（上面板），mt-tRNA亮氨酸（UUR）（中间面板）和mt-tRNA瓦尔（下面板）后分子在体外对shGTPBP3-1和阴性对照（NC）细胞纯化的小RNA进行1、2和3小时的血管生成素（ANG）消化。（B）血管生成素治疗后完整mt-tRNAs的相对丰度。用血管生长素孵育0、1、2和3小时后，完整mt-tRNA的数量通过类似于面板A所示的斑点进行量化，并用未消化NC样品（0小时）的百分比表示。数据是至少三个独立生物复制的平均值±SEM。在*p<0.05时，差异具有统计学意义。（C）mt-tRNA 2-硫代化状态的APM-Northern分析赖氨酸来自NC、shGTPBP3-1和shGTPBP2-2细胞的分子。在存在（+）或不存在（-）APM的情况下，在变性聚丙烯酰胺-尿素凝胶中运行相同数量的总RNA（7.5μg）。在APM存在下，硫代化tRNA被检测为延迟带。实验使用从每个细胞系的至少三个独立培养物中纯化的RNA进行，结果与面板中显示的结果相似。
图3
图3。shGTPBP3细胞显示出更强的抗氧化能力。
（A）使用荧光探针MitoTracker Red通过流式细胞术测定shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和阴性对照（NC）细胞的线粒体膜电位。NC细胞在25 mM叠氮化钠（SA）处理30分钟后作为膜电位下降的阳性对照纳入分析。（B）用克拉克型氧电极测定shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC电池的耗氧率。（C）用流式细胞术测定shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC细胞中的活性氧。（D）流式细胞术测定shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和用0.3 mM h处理（+）或不处理（-）2 h的NC细胞中的ROS2O（运行）2二氢罗丹明123。（E）抗氧化酶活性测定：过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶。A、C、D和E中的数据表示为NC的%。（F）qRT-PCR分析硫氧还蛋白-1,硫氧还蛋白-2,过氧化物还原酶-3,过氧化物酶原-5和解偶联蛋白-2(UCP2号机组)shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC细胞中的mRNA表达。（G）shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC细胞中UCP2的Western blot分析。过滤器也用孔蛋白作为负载对照进行探测。（H）UCP2的密度分析归一化为负荷控制，并表示为NC的%。所有数据均为至少三个独立生物复制的平均值±SEM。与NC值的差异在*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001时具有统计学意义。A.U.：任意单位。
图4
图4。shGTPBP3细胞中ATP水平和复合物I活性降低，而AMPK被激活。
（A）shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和阴性对照（NC）细胞中的ATP水平。（B）线粒体复合物I、II、IV和V活性的测量。所有活性均表示为柠檬酸合成酶比率（（nmol/min/mg蛋白质）/（柠檬酸合酶特异性活性）x 100）。（C）shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC细胞中磷酸化-Thr172-AMPKα的Western blot分析。过滤器也用AMPKα作为负载控制进行了探测。（D）磷酸-Thr172-AMPKα的密度分析归一化为负荷控制，并表示为NC的%。所有数据均为至少三个独立生物复制品的平均值±SEM。与NC值的差异在*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001时具有统计学意义。
图5
图5。稳定击倒GTPBP3号机组表达改变细胞生长、自噬、线粒体大小和体积分数，但相对mtDNA拷贝数保持不变。
（A）阴性对照（NC）（黑方块）、shGTPBP3-1（灰三角）和shGTPBP2-2（灰圈）细胞的生长曲线。（B）shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC单元的倍增时间（h）。（C，D）代表性免疫印迹，使用识别LC3或肌动蛋白（作为负荷控制）的抗体，以及shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC细胞提取物。用（+）或（-）溶酶体（Lys）抑制剂在低（全培养基）条件下培养细胞1小时，C类)或高（磷酸盐缓冲盐水，天)蛋白质水解。LC3-I和LC3-II带的位置显示在左侧。下面的直方图显示了LC3-II的密度测量值，并将其归一化为负载控制，表示为三个独立实验中NC的%。（E）NC、shGTPBP3-1和shGTPBP2-2细胞的代表性电子显微照片（分别为左、中、右面板）。显示细胞核（nc）和一些线粒体（mit）。棒材：1μm。（F-H）平均线粒体面积（F），每μm线粒体数量2细胞质（G）和线粒体体积分数（μm）三线粒体/100μm三shGTPBP3-1、shGTPBP3-2和NC细胞中的细胞质（H）。（一）线粒体编码的定量COX2型与核编码相关的基因SDH公司qPCR检测shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC细胞中的基因。所有数据均为至少三个独立生物重复的平均值±SEM。与NC值的差异在*p<0.05和***p<0.001时具有统计学意义。
图6
图6。线粒体翻译受到GTPBP3敲除的轻度影响。
（A）分析从头开始shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和阴性对照（NC）细胞的线粒体翻译，脉冲标记[35S] -甲硫氨酸在艾美汀存在下维持1小时（ND1至ND6：NADH脱氢酶亚基1至6；CYTB：细胞色素b；COXI、II和III：细胞色素C氧化酶亚基I至III；A6和A8：ATP合成酶亚基6和8）。#shGTPBP3-3细胞系因下调不稳定而被排除在进一步分析之外。（B）放射标记OXPHOS亚基归一化为复合物V的A6亚基并表示为NC的%的密度分析。数据是三个独立生物复制的平均值±SEM。（C和D）氯霉素（D）和环己酰亚胺（E）对NC与shGTPBP3-1和shGTPBP2-2细胞活力的差异影响。方框表示四分位范围。中线代表中间值，晶须盒图代表最小和最大观察值*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
图7
图7
GTPBP3的稳定敲除干扰复合物I组装并降低复合物I装配因子NDUFAF3和NDUFAF（A）的表达对shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和阴性对照（NC）细胞中的OXPHOS亚基ND1、NDUFS3和NDUFB8（复合物I）、SDHA（复合物II）、COXII和COXIV（复合物IV）以及β亚基（复合物V）进行Western blot分析。此外，还用孔蛋白作为负荷控制对过滤器进行了检测。（B）OXPHOS亚基归一化为孔蛋白的密度分析，表示为NC的%。（C）shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC细胞中OXPHOS复合物的代表性蓝色天然PAGE。（D）OXPHOS络合物的密度分析归一化为络合物II（负载控制），并表示为NC的%。（E）qRT-PCR分析C20OR7级,NUBPL公司,NDUFAF3号机组和NDUFAF4号机组shGTPBP3和NC细胞中的mRNA表达。所有数据均为至少三个独立生物复制品的平均值±SEM。与NC值的差异在*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001时具有统计学意义。A.U.：任意单位。
图8
图8。AMPK有助于NDUFAF4的下调。
（A）用AMPKα激活剂AICAR（1 mM）处理（+）或不处理（-）48 h或用AMPK-α抑制剂化合物C（5μM）处理1 h后，对shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和阴性对照（NC）细胞中磷酸化-Thr172-AMPKα进行Western blot分析。也用AMCKα探测过滤器。（B）qRT-PCR分析NDUFAF4号机组如（A）所示，经AICAR或化合物C（CC）处理或不处理的shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC细胞中的mRNA表达。（C和D）用AICAR（C）或用化合物C（D）如（A）中处理（+）或不处理（-）的shGTPBP3-1、shGTPBP3-2和NC细胞中复合物I的蓝色天然PAGE分析。（E）复合物I的密度分析归一化为负荷控制，并表示为NC的%。所有数据均为至少三个独立生物复制的平均值±SEM。在*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001时，差异具有统计学意义。注：无显著差异。A.U.：任意单位。
图9
图9。AMPK激活有助于UCP2的诱导和MPC1的下调。
（A）用AMPKα激活剂AICAR（1 mM）处理（+）或不处理（-）的shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和阴性对照（NC）细胞中磷酸化-Thr172-AMPKα的Western blot分析（1 h）或用AMPK-α抑制剂化合物C（5μM）处理1 h。（B）qRT-PCR分析UCP2号机组mRNA在shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC细胞中的表达，AICAR（1 mM）处理或不处理1和48小时，或化合物C（CC，5μM）处理1小时。（C）qRT-PCR分析MPC1shGTPBP3-1、shGTPBP2-2和NC细胞中的mRNA表达，无论是否用AICAR（1 mM）或化合物C（CC，5μM）处理，均持续1h。所有数据均为至少三个独立生物复制的平均值±SEM。在*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001时，差异具有统计学意义。n.s.：无显著差异，A.U.：任意单位。
图10
图10。糖酵解和脂肪酸氧化相关基因在shGTPBP3细胞中的mRNA表达增加。
糖酵解相关基因mRNA表达的qRT-PCR分析(GLUT1公司：葡萄糖转运蛋白1，PKF1系列：磷酸果糖激酶，以及LDHA公司和低密度血红蛋白：分别为乳酸脱氢酶A和B），2）脂肪酸氧化(CPT1型：肉碱棕榈酰转移酶I，生命周期评价：长链酰基辅酶A脱氢酶，以及单克隆抗体：中-链酰基辅酶A脱氢酶）和3）谷氨酰胺水解(ASCT2型：谷氨酰胺/氨基酸转运蛋白2，序号2：谷氨酰胺/氨基酸转运系统N，以及GLS公司：谷氨酰胺酶）在shGTPBP3-1、shGTPBP3-2和NC细胞中的表达。数据是至少三个独立生物复制的平均值±SEM。与NC值的差异在*p<0.05、p<0.01和***p<0.001时具有统计学意义。A.U.：任意单位。
图11
图11。shGTPBP3细胞葡萄糖和脂肪酸代谢途径的建议方案。
葡萄糖摄取受葡萄糖转运蛋白（如GLUT1）向细胞膜的移位调节。在糖酵解中，使葡萄糖分解代谢的第一个调节步骤由磷酸果糖激酶（PFK1）控制，而最后一个步骤由丙酮酸激酶催化生成丙酮酸和ATP。丙酮酸要么被氧化（葡萄糖氧化），要么被乳酸脱氢酶（LDH）转化为乳酸。当糖酵解与葡萄糖氧化耦合时，丙酮酸通过线粒体丙酮酸载体（MPC）进入线粒体，并通过丙酮酸脱氢酶（PDH）转化为乙酰辅酶A，该酶受丙酮酸激酶（PDK）和丙酮酸磷酸酶的调节。最后，乙酰辅酶A并入三羧酸循环（TCAC）。NADH和FADH2TCAC酶产生的产物分别通过复合物I和复合物II进入线粒体电子传递链。长链脂肪酸利用肉碱穿梭器（包括肉碱棕榈酰转移酶I（CPTI））穿过线粒体膜。脂肪酸氧化（FAO）产生乙酰辅酶A，其并入TCAC、NADH和FADH2分别通过复合物I和ETF-泛醌氧化还原酶在电子传递链中使用。脂肪酸和葡萄糖代谢可以通过兰德循环相互调节[75117]。在复合物I受损的shGTPBP3细胞中，AMPK激活导致MPC1（形成MPC的两个亚单位之一）的下调和UCP2的上调。shGTPBP3细胞中UCP2的增加有利于苹果酸和草酰乙酸（OAA）从线粒体中输出，促进FAO。MPC的降低也可能是适应性反应的一部分，这种适应性反应调用FAO和分支链氨基酸的氧化，以提供OXPHOS系统的还原当量。然而，NADH对NAD的回收不足+由于复合物I的活性较低，可能会限制代谢重编程对OXPHOS容量的影响。这种情况，再加上旨在防止膜电位急剧下降的复合物V的反向操作，可以解释shGTPBP3细胞中ATP水平低的原因。这些降低的ATP水平和糖酵解与丙酮酸氧化的脱钩可能会增加质子和乳酸的生成，对心脏等组织有害。在图中，红线和绿线表示监管行动。
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