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.2015年9月；6(9-10):428-44.
doi:10.18632/genesandcarcer.77。

p52-NF-κB亚基和雄激素受体（AR）相互作用抑制剂通过消除p52和磷酸化AR的核转位来减少人类前列腺癌细胞的生长（ser81）

Farideh Mehraein Ghomi公司 1, Dawn R教堂 1, 辛西娅·施赖伯 1, 阿什利·M·魏希曼 1, 希拉克·S·巴苏 1, 乔治·威尔丁 2
附属公司

p52 NF-κB亚单位和雄激素受体（AR）相互作用抑制剂通过消除p52和磷酸化AR（ser81）的核移位减少人类前列腺癌细胞的生长

Farideh Mehraein-古米等。 基因癌症. 2015年9月.

摘要

越来越多的证据表明，雄激素受体（AR）的激活和信号传导在前列腺癌各个阶段的生长和进展中起着关键作用，即使在低雄激素水平或去势抵抗前列腺癌中雄激素缺乏的情况下也是如此。雄激素分泌条件下AR的持续激活可能是由于其与共激活物（如p52 NF-κB亚单位）的相互作用，和/或通过延迟其降解的磷酸化增加其稳定性。在这里，我们通过基于Gaussia荧光素酶重组的高通量筛选，鉴定了AR/p52相互作用的特异性抑制剂AR/p52-02。我们发现AR/p52-02在低雄激素条件下显著抑制去势抵抗C4-2（IC50～6μM）和亲代雄激素依赖性LNCaP（IC50至4μM）人类前列腺癌细胞的生长。生长抑制与核p52水平和DNA结合活性显著降低、丝氨酸81处AR磷酸化降低、AR泛素化增加和AR转录活性降低有关，这两种细胞系中前列腺特异性抗原（PSA）mRNA水平降低表明。AR/p52-02还导致p21（WAF/CIP1）水平降低，这是一种直接的AR靶向基因，因为其表达与雄激素生理水平下前列腺癌的雄激素刺激和有丝分裂增殖相关，可能是通过干扰AR信号轴。先前报道的该化合物cyclinD1水平降低可能是由于p52的核存在和活性降低，p52直接调节cyclinD1的表达，以及p21（WAF/CIP1）的降低，因为p21（WAF/CIPl）被报道用于稳定前列腺癌中的核cyclinB1。总的来说，数据表明，特异性抑制AR与p52的相互作用以及阻断p52和pARser81的活性可能是减少去势抵抗前列腺癌细胞生长的有效手段。

关键词：应收账；NF-κB2/p52；前列腺癌；蛋白质相互作用抑制剂。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作家F.Mehraein-Ghomi、D.Church、H.Basu和G.Wilding存在潜在的利益冲突。

数字

图1
图1。含有融合基因NF-κB2/p52-Gluc2的载体表达融合蛋白，由于p52和雄激素受体的相互作用，Gaussia荧光素酶被重组
用载体控制或含有融合基因cmv-p52-Gluc2（A）的载体转染Hep3B细胞。转染后收集细胞裂解物，并使用NF-κB2/p52（B）抗体或高斯（Gaussia）荧光素酶（Gluc）（C）。在（D）中，高斯（Gaussia）用cmv-Gluc1-AR联合转染Hep3B细胞的裂解液测定荧光素酶活性≠+cmv-p52-Gluc2或cmv-Gluc1-AR+cmv-OF-p52-Glus2（p52与Gluc2的帧外融合；控制向量）。活动显著增加6倍(*P（P）与cmv-Gluc1-AR+cmv-OFp52-Gluc2对照组相比，在联合转染cmv-Gluc1-AR+cmv-p52-Gluc2的细胞中观察到<0.0002），表明p52-Ggluc2融合蛋白的表达以及重组高斯（Gaussia）荧光素酶由于AR和p52的相互作用。N=6每种条件高斯（Gaussia）荧光素酶活性研究。≠cmv-Gluc1-AR载体此前已发表[31]。
图2
图2。p52 NF-κB亚基和AR相互作用抑制剂的筛选
基于高斯（Gaussia）如（a）所示，在含有2800个小分子的生命化学库子集上，对与载体cmv-p52-Gluc2和cmv-Gluc1-AR共同转染的Hep3B细胞的细胞裂解液中的荧光素酶重建进行。发现四个“点击”在没有雄激素的情况下特异性抑制p52与雄激素受体（AR）的直接相互作用。AR/p52相互作用的四种小分子抑制剂的结构如（B）所示。使用PolarScreen™雄激素受体竞争对手试验进一步筛选四种抑制剂，以消除任何具有抗雄激素特性的抑制剂（C）。比卡鲁胺（Casodex®）是一种临床抗雄激素药物，用作对照。观察到比卡鲁胺与荧光标记雄激素（荧光酮）竞争结合AR配体结合域（LBD）的经典剂量反应。相反，在相同剂量范围内，没有一种AR/p52抑制剂与雄激素竞争结合AR的LBD。根据该分析，这些化合物均被归类为非抗雄激素类。每个数据点N=3，非线性回归拟合曲线，代表对每种化合物进行的两次分析。
图3
图3。抑制LNCaP和C4-2细胞生长化合物的筛选
测试化合物在低雄激素培养基（−R）（A，B）或含有生理水平1nM合成雄激素R1881（+R）（C，D）的培养基中抑制LNCaP细胞（A，C）或C4-2细胞（B，D）生长的能力。用递增剂量的化合物或零剂量的化合物载体对照物处理细胞96小时。与零剂量对照（对照DNA百分比）相比，显示了剂量反应对生长的影响。增长IC50表1。N=每个数据点6至12。
图4
图4。AR/p52-02在低雄激素条件下降低LNCaP和C4-2细胞的PSA mRNA
LNCaP（A）或C4-2（B）细胞在低雄激素介质中培养过夜，然后在存在或不存在2nM合成雄激素R1881（R）的情况下，使用或不使用10μM AR/p52-02处理。24、48或72小时后，使用Invitrogen的cells-to-cDNA试剂盒收集细胞进行实时定量PCR分析，以评估每种条件下PSA的表达水平。根据低雄激素（−R）条件下LNCaP和C4-2细胞中PSA表达的测定，AR/p52-02显著降低AR转录活性，但不影响AR转录活性的雄激素诱导（+R）：AR/p52-01显著降低低雄激素条件下PSA mRNA(*P（P）LNCaP和C4-2细胞中所有时间点的−R与–R+AR/p52-02相比均<0.05。正如预期的那样，2nM雄激素刺激导致LNCaP细胞PSA mRNA显著增加～16倍（所有时间点+R的P<0.001，而-R的P<0.01）。C4-2细胞对雄激素刺激也有反应，但仅增加～3倍（所有比较***P<0.01）。在2nM雄激素刺激条件下，AR/p52-02对两种细胞系的PSA mRNA水平均无影响，因为在任何时间点，+R与+R+AR/p52-002相比均无差异。两次实验之间，每种条件N=6。
图5
图5。AR/p52-02对雄激素依赖性LNCaP细胞AR和p52 NF-κB亚单位水平的影响
LNCaP细胞在低雄激素培养基中培养过夜，然后在存在或不存在2nM合成雄激素R1881（R）的情况下，使用或不使用5μM AR/p52-02（02）处理72小时。处理后，分离核蛋白提取物，并通过western blotting（WB）评估AR和p52的水平。不出所料，雄激素增加了LNCaP细胞的核AR（A）和p52（B）水平（+R比-R）。与未经治疗的–R和+R对照组相比，AR/p52-02治疗对核AR水平没有显著影响（A）。相反，在–R和+R条件下，与相应的对照组相比，AR/p52-02治疗显著降低了p52的核水平（B）。使用LaminB1作为加载对照。AR/LaminB1的比率显示在每条车道的下方，每个点的–R控制比率设置为1。α-微管蛋白缺乏表明细胞核纯度。实验至少重复了三次。
图6
图6。AR/p52-02对去势耐药C4-2细胞AR和p52 NF-κB亚基水平的影响
C4-2细胞在低雄激素培养基中培养过夜，然后在存在或不存在（±）2nM合成雄激素R1881（R）的情况下，使用或不使用10μM AR/p52-02（02）处理72h，并通过western blot（WB）分析核AR（A）和p52（B）。核水平进一步通过免疫细胞化学（ICC）检测AR核水平（C）和TransAM™分析检测p52 DNA结合活性，作为核p52水平（D）的指标。Western blot表明AR/p52-02在–R（低雄激素）条件下导致AR核水平降低（a），ICC结果证实了在–R条件下药物显著降低AR核水平（C）。western（B）和binding activity（D）分析均表明，AR/p52-02处理在–R和+R条件下均导致p52的核水平显著降低。对于WB，使用LaminB1作为荷载控制，AR/LaminB1的比率显示在每条车道的下方，每个点的–R控制比率设置为1；α-微管蛋白缺乏显示细胞核纯度；实验重复了三次。对于AR ICC分析，条件N≥9，对于p52 DNA结合分析，条件N=3。虚线表示分别对–R和+R样品进行TransAm™分析*P（P）与相应的-R或+R未治疗对照组相比，<0.05。
图7
图7。AR/p52-02对AR磷酸化的影响
抑制剂AR/p52-02降低低雄激素状态下LNCaP和C4-2细胞中雄激素受体（AR）的ser81磷酸化。分别用5μM或10μM AR/p52-02（02）处理LNCaP和C4-2细胞，在2nM合成雄激素R1881（R）存在或不存在（±）的情况下处理72h，并测定总磷酸化AR水平序列81（pAR序列81)用全细胞裂解液（A）中的蛋白质印迹（WB）分析AR（AR441）。pAR水平序列81细胞核（nuc）和细胞质（cyt）的蛋白质印迹（B）也进行了评估。总AR水平在治疗过程中没有变化，因为在任何条件下都没有观察到变化（A）。总pAR序列81在低雄激素条件下（−R），AR/p52-02降低LNCaP和C4-2细胞中的水平，但在雄激素（+R）（A）存在的情况下没有影响。AR/p52-02降低了LNCaP细胞的核水平，而在–R条件下C4-2细胞的核和细胞质水平均降低（B）。在+R条件下，AR/p52-02对细胞核或细胞质水平没有影响（数据未显示）。β-肌动蛋白作为负载对照，pAR的比率第81页/β-肌动蛋白显示在每个泳道下方，每个印迹中的对照比例设置为1。实验重复了三次。
图8
图8。AR/p52-02对AR稳定性的影响
抑制剂AR/p52-02通过增加AR的泛素化和蛋白酶体降解，导致AR不稳定。在存在（+）或不存在（-）2nM雄激素R1881（R）的情况下，用蛋白酶体抑制剂MG132和（+）AR/p52-02抑制剂处理LNCaP和C4-2细胞12小时。使用AR441抗体（IP:AR）对细胞裂解物进行免疫沉淀，并使用泛素（Ub）和AR抗体对免疫沉淀进行免疫印迹分析。在–R和+R条件下，使用AR/p52-02处理的LNCaP和C4-2细胞中观察到AR泛素化增加。每个泳道下面显示了来自IP:AR、IB:Ub的泛化AR与来自IP:AR、IB:AR的总AR的比率，每个斑点中的控制比率设置为1。实验重复了三次。
图9
图9。AR/p52-02降低雄激素存在时p21的水平
分别用5μM和10μM AR/p52-02（02）抑制剂处理LNCaP和C4-2细胞，在存在或不存在2nM合成雄激素R1881（R）的情况下，通过使用p21抗体的western blotting（WB）测定全细胞裂解液中p21的水平。在对照组或AR/p52-02处理的LNCaP细胞（A）中没有R1881（−R）时，p21未被检测到，但在雄激素存在下，观察到p21的诱导（+R比-R），随着AR/p52-012（+R+02）的减少。在C4-2细胞（B）中，p21在–R和+R中检测到类似水平，并且在+R条件下通过AR/p52-02处理降低。β-actin作为蛋白质负荷控制。实验重复了三次。
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引用人

工具书类

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