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.2016年1月1日；8（1）：6-24。
doi:10.15252/emmm.201505433。

KLF4是脑海绵状血管畸形发展和进展的关键决定因素

罗伯托·库塔诺 1, 诺埃米·鲁迪尼 1, 卢卡·布拉维 1, 莫妮卡·科拉达 1, 科斯坦扎·詹皮特罗 2, 埃琳娜·帕帕 三, 马可·弗朗西斯科·莫里尼 4, 路易吉·马达卢诺 5, 尼古拉斯·拜恩斯 6, 拉尔夫·H·亚当斯 7, 穆克什·K·贾恩 8, 加里·欧文斯 9, 舒华兹 6, 玛丽亚·格拉齐亚·兰普格纳尼 10, 伊丽莎白·德贾纳 11
附属公司

KLF4是脑海绵状畸形发展和进展的关键决定因素

罗伯托·库塔诺等。 EMBO分子医学. .

摘要

脑海绵状血管畸形（CCM）是位于中枢神经系统内的血管畸形，常导致脑出血。由于目前的治疗仅限于神经外科，因此需要进行药物治疗。家族性CCM是由任何Ccm1、Ccm2和Ccm3基因的功能丧失突变引起的。CCM海绵体瘤由经历内皮-间充质转化（EndMT）的内皮细胞（EC）排列。这种表型转换是由于转化生长因子β/骨形态发生蛋白（TGFβ/BMP）信号的激活。然而，连接Ccm基因失活和TGFβ/BMP依赖性EndMT的机制尚不明确。在这里，我们报告了Ccm1消融导致MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2信号轴激活，该信号轴诱导体内EC中的Kruppel-like factor 4（KLF4）强烈增加。KLF4转录活性是CCM1-null EC中发生EndMT的原因。KLF4通过产生BMP6促进TGFβ/BMP信号传导。重要的是，在内皮特异性Ccm1和Klf4双敲除小鼠中，我们观察到CCM的发展和小鼠死亡率显著降低。我们的数据显示KLF4是CCM的治疗靶点。

关键词：CCM；末端MT；KLF4；转化生长因子β‐骨形态发生蛋白；内皮细胞。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。荷兰皇家空军4是以下项的行列式CCM（中央控制模块）发展体内

  1. 的代表性图像重量,国际CCM1，和iCCM公司1/荷兰皇家空军P12的4个小鼠大脑(n个=每个基因型5个）。比例尺：500μm。

  2. 典型共焦分析价值工程‐卡德林（绿色）和荷兰皇家空军血管病变（虚线区域）和假性正常小脑血管（白色箭头）中有4个（红色）重量,国际CCM1，和iCCM公司1/荷兰皇家空军4只小鼠(n个=每组4人）。价值工程‐卡德林标识欧盟委员会s；DAPI公司可视化细胞核。比例尺：50μm。

  3. qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应两者的通信委员会1和Klf4公司在新鲜分离的大脑上进行的表达欧盟委员会s由导出重量,国际CCM1，和国际CCM1/荷兰皇家空军第12页为4只小鼠。基因表达的折叠差异与重量老鼠。数据为平均值±标准偏差(n个=4–5/组）。双尾非配对t吨进行了测试。通信委员会1: ***P（P） = 0.0004;Klf4公司: ***P（P） = 0.0003, ****P（P）=1.43E‐05。

  4. 小脑血管病变数量和大小的量化国际CCM1和iCCM公司1/荷兰皇家空军第12页为4只小鼠。列表示平均值±标准偏差(n个=2窝每种基因型3只）。双尾非配对t吨进行了对比测试国际CCM1对国际CCM1/荷兰皇家空军4.＜5000μm2: **P（P） = 0.0018; 5–1000微米2: *P（P） = 0.0117; >10000微米2: **P（P） = 0.0019.

  5. Kaplan–Meier生存曲线重量,国际CCM1，和国际CCM1/荷兰皇家空军4只小鼠(n个=每组8）。进行了Mantel–Cox统计检验：***P（P） < 0.0001.

图EV1
图EV1。Klf4公司对视网膜海绵状瘤的发展和进展至关重要
  1. A类

    异凝集素B4染色(IB公司4，用于识别血管）重量,iCCM公司1和国际CCM1/荷兰皇家空军P12处4个视网膜。虚线区域突出了CCM（中央控制模块）病变面积介于国际CCM1和国际CCM1/荷兰皇家空军4只小鼠。图像代表了每种基因型的五只小鼠。比例尺：500μm。

  2. B类

    代表性免疫染色（三分之一进行，n个=每组3人）荷兰皇家空军4（浅蓝色）在视网膜重量,国际CCM1，和国际CCM1/荷兰皇家空军4只小鼠。在isolectin B4染色（红色）后显示视网膜周围的血管。比例尺：60μm。

  3. C–E类

    量化血管病变覆盖的视网膜面积百分比（C）、丛前缘的血管前沿密度（D）和生长血管覆盖的平均距离（E）重量,国际CCM1，和国际CCM1/千磅/平方英尺第12页为4只小鼠。数据为平均值±标准偏差(n个=来自三个不同窝的每个基因型5）。双尾非配对t吨进行了测试***P（P） = 0.0003, **P（P） = 0.004.

图EV2
图EV2。荷兰皇家空军4损失后增加金额通信委员会1,Ccm2，和立方厘米

  1. qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应分析Klf4公司在三苯氧胺诱导的不同时间（P3、P5和P9）疾病进展期间通信委员会1新分离脑中的重组（P1）欧盟委员会s派生自重量和国际CCM1只老鼠。数据为平均值±标准偏差(n个=每组3人）。折叠变化与重量动物。双尾非配对t吨进行了测试*P（P） = 0.0143, **P（P） = 0.002,## P（P） = 0.001.

  2. 代表性免疫染色荷兰皇家空军4（红色）与PECAM公司1（绿色，用于识别欧盟委员会s） 在大脑切片中国际CCM2,国际CCM3只小鼠及其亲属重量控制（执行三分之一）。细胞核用可视化DAPI公司; 虚线区域突出显示病变区域。比例尺：50μm。

图EV3
图EV3。增加ERK公司5磷酸化负责荷兰皇家空军4上调和荷兰皇家空军4依赖端机器翻译在两者都不存在的情况下CCM（中央控制模块）2和CCM（中央控制模块）三

  1. qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应分析Klf4公司在里面WT EC公司s转染了任一si核糖核酸指向三个人中的任何一个人立方厘米基因或控制si核糖核酸数据表示为平均值±标准偏差(n个 = 3). 结果显示为相对于对照si的折叠变化核糖核酸‐经过处理欧盟委员会s.双尾非配对t吨进行了测试***P（P） = 0.0001,### P（P） = 0.0009, **P（P） = 0.0017.

  2. 工作分解结构分析pERK公司5,ERK公司5，和千磅/平方英尺4英寸肺源性重量和CCM（中央控制模块）2KO EC公司s经过处理XMD公司8-92或车辆72小时。两者都有pERK公司5/ERK公司5比率和荷兰皇家空军用密度扫描法对负载控制液vinculin标准化的4个量进行定量。工作分解结构结果代表了三个独立的观察结果。

  3. qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应属于Ccm2、Klf4、Bmp6，还有一些结束机器翻译中的标记重量和CCM（中央控制模块）2KO EC公司s经过处理XMD公司8-92或车辆72小时。qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应结果显示为平均值±标准偏差(n个=3），折叠变化与车辆处理有关WT EC公司s.双尾非配对t吨进行了测试。立方厘米: ***P（P） = 0.0003;Klf4公司: ***P（P） = 0.0002, **P（P） = 0.006;Bmp6型: **P（P） = 0.0018, ****P（P）=8.7E‐05；Fsp1型: **P（P） = 0.0013, ****P（P）=6.5E‐05***P（P） = 0.0008;Sca1型: **P（P） = 0.001,## P（P）=0.0025*P（P） = 0.029;同上: **P（P） = 0.0013,## P（P） = 0.0029.

  4. 工作分解结构分析pERK公司5,ERK公司5，和荷兰皇家空军4英寸肺源性重量和CCM（中央控制模块）三KO EC公司s经过处理XMD公司8‐92或车辆72小时。两者都有pERK公司5/ERK公司5比率和荷兰皇家空军如（A）所示，对4个样本进行归一化和量化。

  5. qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应属于Ccm3、Klf4、Bmp6、，还有一些结束机器翻译中的标记重量和CCM（中央控制模块）三KO EC公司s经过处理XMD公司8‐92或车辆72小时，量化如（C）所示。立方厘米: ****P（P） < 0.00001;Klf4公司: ****P（P） < 0.00001;Bmp6型: ****P（P） < 0.00001, ***P（P） = 0.0009, *P（P） = 0.01;Fsp1型: ***P（P） = 0.0002, ****P（P） < 0.00001,#### P（P）=3.8E‐05；Sca1型: ****P（P） < 0.00001,#### P（P）=4.79E‐05**P（P） = 0.0013;同上: **P（P） = 0.0039,## P（P） = 0.0017.

可在线获取此图的源数据。
图2
图2。荷兰皇家空军4在人脑细胞系中增加CCM（中央控制模块）1和在CCM（中央控制模块）1名患者

  1. 左侧面板：通信委员会1和Klf4公司相对的信使核糖核酸中的级别CCM1（中央控制模块1）（siCCM（中央控制模块）1） 和控制（siCTRL键)硅核糖核酸‐经过处理hCMEC公司/D3.结果显示，si基因表达的折叠变化CCM（中央控制模块）1治疗组与对照组。数据表示为平均值±标准偏差(n个 = 3). 双尾非配对t吨进行了测试****P（P） < 0.00001,#### P（P）=1.2E‐05。右侧面板：工作分解结构分析荷兰皇家空军4硅含量CCM（中央控制模块）1‐和siCTRL键‐经过处理hCMEC公司/D3.Tubulin用作加载控制。这些数据代表了三个独立的观察结果。

  2. 家族性脑组织连续切片的免疫组织化学分析CCM（中央控制模块）1名患者。苏木精和曙红（左侧面板），克劳丁5（中央面板），以及荷兰皇家空军作为对照脑组织，在脑损伤和正常病变周围血管中进行4次（右面板）染色。高倍图像荷兰皇家空军显示了装箱区域的4种染色。克劳丁5个标识欧盟委员会s和箭头标记内皮荷兰皇家空军4个阳性细胞核。比例尺：100μm。这些数据代表了三个独立的观察结果。

可在线获取此图的源数据。
图3
图3。荷兰皇家空军4调节结束机器翻译接通CCM（中央控制模块）1KO EC公司秒
  1. A–D

    培养肺源性重量和CCM（中央控制模块）1KO EC公司s与sh慢病毒转导核糖核酸直接发送给任一方Klf4公司（第页荷兰皇家空军4） 或控制顺序（shCTRL键). （A）qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应间充质的(Fsp1，Id1)，干细胞样(Sca1型)和内皮标记物(价值工程钙粘蛋白和克劳丁5)英寸重量第页CTRL键,重量第页荷兰皇家空军4,CCM（中央控制模块）1击倒对手第页CTRL键、和CCM（中央控制模块）1击倒对手第页千磅/平方英尺4欧盟委员会s.数据为平均值±标准偏差(n个 = 3). 基因表达的折叠差异与重量第页控制ECs.双尾非配对t吨进行了测试。Klf4公司: ****P（P） < 0.00001, ***P（P） = 0.0008, **P（P） = 0.007;Fsp1型: ***P（P）=0.0001****P（P）=3.9 E‐05，### P（P） = 0.0002;Sca1型: ***P（P） = 0.0001, ****P（P） < 0.00001;同上: ***P（P） = 0.0001;血管钙粘蛋白: ***P（P） = 0.0001;Claudin5型: ****P（P）=1.37E‐05。（B）工作分解结构第页，共页机器翻译中的标记重量第页CTRL键,重量第页荷兰皇家空军4,CCM（中央控制模块）1击倒对手第页CTRL键、和CCM（中央控制模块）1击倒对手第页荷兰皇家空军4欧盟委员会s.文丘林是装载控制装置。这些数据代表了三个独立的观察结果。（C） 的扩散率重量第页CTRL键,重量第页荷兰皇家空军4,CCM（中央控制模块）1击倒对手第页CTRL键、和CCM（中央控制模块）1击倒对手第页荷兰皇家空军4欧盟委员会s培养5天。列表示平均值±标准偏差(n个 = 8). 双尾非配对t吨进行了测试。培养3天：***P（P） = 0.0001, **P（P） = 0.0045,## P（P） = 0.0017; 培养5天：***P（P） = 0.0001, **P（P） = 0.0029,## P（P） = 0.0040. （D） 伤口试验中测量的迁移率重量第页CTRL键,CCM（中央控制模块）1击倒对手第页CTRL键、和CCM（中央控制模块）1击倒对手第页荷兰皇家空军4欧盟委员会s.平均值±标准偏差显示了(n个 = 6). 双尾非配对t吨进行了测试***P（P） = 0.0004,### P（P） = 0.0009.

  2. E类

    培养肺源性WT EC公司用全长小鼠慢病毒转导sKlf4公司（伦蒂千磅/平方英尺4） 或空向量（模拟）。qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应（左侧面板）和工作分解结构End（右面板）机器翻译Mock和Lenti中的标记荷兰皇家空军4欧盟委员会第条。qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应数据为平均值±标准偏差(n个=3），褶皱变化与模型有关欧盟委员会s.双尾非配对t吨进行了测试**P（P） = 0.002, ***P（P） = 0.0007,### P（P） = 0.0001.工作分解结构结果代表了三个独立的观察结果。Tubulin是装载控制装置。

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图EV4
图EV4。ERK公司5‐荷兰皇家空军4轴调节结束机器翻译在初级大脑中CCM（中央控制模块）1KO EC公司秒

  1. 上部面板：qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应两者的通信委员会1和Klf4公司基因重组效率在体外 周转时间原发性脑Cre‐重组酶治疗欧盟委员会s派生自重量,通信委员会1 飞行/飞行、和通信委员会1 飞行/飞行/Klf4公司 飞行/飞行小鼠来源培养重量,CCM（中央控制模块）1击倒对手、和CCM（中央控制模块）1‐千磅/平方英尺4击倒对手脑欧盟委员会s、 分别（每个基因型每个实验复制10只小鼠）。数据表示为平均值±标准偏差(n个 = 3). 折叠变化与重量脑欧盟委员会s.双尾非配对t吨进行了测试。通信委员会1: **P（P） = 0.001;Klf4公司: ****P（P） < 0.00001,#### P（P）=5.2E‐05。下部面板：工作分解结构属于荷兰皇家空军4英寸重量,CCM（中央控制模块）1击倒对手、和CCM（中央控制模块）1‐荷兰皇家空军4击倒对手脑欧盟委员会如上所述。Vinculin是负载控制。这些数据代表了三个独立的观察结果。

  2. 代表性共焦分析（共进行三次）荷兰皇家空军4（红色）和价值工程‐卡德林（绿色）英寸重量,CCM（中央控制模块）1击倒对手、和CCM（中央控制模块）1‐荷兰皇家空军4击倒对手初级大脑欧盟委员会s如（A）所示。比例尺：30μm。

  3. qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应第页，共页机器翻译中的标记重量,CCM（中央控制模块）1击倒对手、和CCM（中央控制模块）1‐荷兰皇家空军4击倒对手脑欧盟委员会s如（A）所示。数据为平均值±标准偏差(n个 = 3). 折叠变化与WT EC公司s.双尾非配对t吨进行了测试。Fsp1型以下为：***P（P） = 0.0006, **P（P） = 0.0011;Sca1型: ****P（P） < 0.00001,#### P（P）=7.7E‐05；同上: **P（P） = 0.0017;鼻涕虫: *P（P） = 0.02,# P（P） = 0.01;Bmp6型: **P（P） = 0.003.

  4. 工作分解结构属于金融服务提供商1,SCA公司1,身份证件1，和SLUG公司在里面重量,CCM（中央控制模块）1击倒对手、和CCM（中央控制模块）1‐千磅/平方英尺4击倒对手脑欧盟委员会如（A）所述获得。Tubulin是装载控制装置。这些数据代表了三个独立的观察结果。

  5. 分析pERK公司5和ERK公司5种蛋白质水平重量,CCM（中央控制模块）1击倒对手、和CCM（中央控制模块）1‐荷兰皇家空军4击倒对手脑欧盟委员会s如（A）所示。pERK公司5/ERK公司5表示微管蛋白的归一化比率。

  6. 工作分解结构分析pERK公司5,ERK公司5,荷兰皇家空军4,金融服务提供商1,斯卡1,身份证件1（左侧面板），和qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应属于Bmp6型（右侧面板）英寸重量和CCM（中央控制模块）1击倒对手脑欧盟委员会s、 如（A）所述获得，然后用XMD公司8-92或车辆72小时。qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应结果显示为平均值±标准偏差(n个=3），折叠变化与车辆处理有关WT EC公司s.双尾非配对t吨进行了测试**P（P）=0.001***P（P） = 0.0006, ****P（P）=6.3E‐05。工作分解结构结果代表了三个独立的观察结果，微管蛋白是负荷控制因素。

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图EV5
图EV5。终点机器翻译标记表达在缺少荷兰皇家空军4体外和体内
  1. A类

    qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应某个端的机器翻译新鲜分离大脑中的标记物欧盟委员会s来自重量,国际CCM1，和国际CCM1/荷兰皇家空军第12页分析了4只小鼠。折叠变化与重量动物。数据为平均值±标准偏差来自三个代表性实验中的一个。

  2. B–D类

    （B）的典型共焦分析PECAM公司1（绿色）和金融服务提供商1（红色），（C）GLUT公司1（绿色）和SCA公司1（红色）或（D）PECAM公司1（绿色）和身份证件1（红色）在正常小脑血管中重量小鼠和两者的血管病变（虚线区域）国际CCM1和国际CCM1/千磅/平方英尺4只小鼠(n个=每组4人）。PECAM公司1表示欧盟委员会s；DAPI公司可视化细胞核。比例尺：50μm。

图4
图4。荷兰皇家空军增加4次Bmp6型表达和SMAD公司1磷酸化欧盟委员会秒

  1. qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应属于Bmp6型中的表达式重量第页CTRL键,重量第页荷兰皇家空军4,CCM（中央控制模块）1击倒对手第页CTRL键、和CCM（中央控制模块）1击倒对手第页千磅/平方英尺4培养欧盟委员会s.数据表示平均值±标准偏差(n个 = 3). 折叠变化与CCM（中央控制模块）1击倒对手第页控制ECs.双尾非配对t吨进行了测试****P（P） < 0.00001.

  2. 工作分解结构属于pSMAD公司1和SMAD公司1英寸重量第页CTRL键,重量第页荷兰皇家空军4,CCM（中央控制模块）1击倒对手第页CTRL键、和CCM（中央控制模块）1击倒对手第页荷兰皇家空军4欧盟委员会第条。pSMAD公司1/SMAD公司1微管蛋白的归一化比率通过密度扫描进行量化。这些数据代表了三个独立的观察结果。

  3. 免疫组织化学分析PECAM公司1（左侧面板）和BMP公司6（中央面板）在来自重量,国际CCM1，和国际CCM1/荷兰皇家空军4只小鼠在P12。方框区域的放大倍数较高的图像显示在右侧面板中。黑色箭头标记欧盟委员会s和虚线区域表示浦肯野细胞层用作染色的阳性对照。比例尺：100μm。这些数据代表了三个独立的观察结果(n个=每个基因型3个）。

  4. 中国IP（IP）分析荷兰皇家空军4绑定到Bmp6型发起人。假定荷兰皇家空军显示了MatInspector识别的4个结合位点。的级别DNA标准化为输入。列为平均值±标准偏差三份代表性实验中的三份。

  5. 转录报告分析在赫克‐293细胞转染Bmp6型启动子报告质粒和一个空载体，一个全长荷兰皇家空军4个或一个突变体荷兰皇家空军4缺少DNA结合锌指域(荷兰皇家空军4∆ZnF）。图中红色方框表示千磅/平方英尺Ch验证的4个结合位点IP（IP）.将更改折叠在Bmp6型启动子活性与空载体转染细胞有关。数据为平均值±标准偏差(n个 = 3). 双尾非配对t吨进行了测试****P（P） < 0.00001,#### P（P）=5.8E‐05。

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图5
图5。荷兰皇家空军4推广End机器翻译通过BMP公司6上调
  1. A类

    qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应属于Bmp6型在Mock和Lenti中荷兰皇家空军4培养欧盟委员会s.数据为平均值±标准偏差(n个 = 3). 折叠变化与模拟有关欧盟委员会s.双尾非配对t吨进行了测试**P（P） = 0.0034.

  2. B类

    工作分解结构属于pSMAD公司1和SMAD公司1英寸Mock and Lenti荷兰皇家空军4欧盟委员会s.文丘林是装载控制装置。pSMAD公司1/SMAD公司用密度扫描法对1比归一化的vinculin进行定量。这些数据代表了三个独立的观察结果。

  3. C类

    中国IP（IP）属于荷兰皇家空军4与互动Bmp6型Mock和Lenti的发起人荷兰皇家空军4欧盟委员会s.推定的荷兰皇家空军显示了MatInspector识别的4个结合位点。的级别DNA标准化为输入。列为平均值±标准偏差三份代表性实验中的三份。

  4. D–F型

    莫克和伦蒂荷兰皇家空军4培养欧盟委员会s是用sh转导的慢病毒核糖核酸直接发送给任一方Bmp6型（sh）BMP公司6） 或控制顺序（shCTRL键). （D）qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应分析Bmp6型在模拟中CTRL键，模拟BMP公司6、伦蒂荷兰皇家空军4什CTRL键和伦蒂荷兰皇家空军4什BMP公司6欧盟委员会第条。qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应数据表示平均值±标准偏差(n个=3），褶皱变化与模拟sh有关控制ECs.双尾非配对t吨进行了测试***P（P）=0.0008**P（P） = 0.004,## P（P） = 0.003.工作分解结构属于pSMAD公司1和SMAD公司1（E）或结束机器翻译模拟sh中的标记（F）CTRL键，模拟BMP公司6、伦蒂荷兰皇家空军4什CTRL键和伦蒂千磅/平方英尺4什BMP公司6培养欧盟委员会第条。pSMAD公司1/SMAD公司1比率的量化如（B）所示。这些工作分解结构这些数据代表了三个独立的观测结果。Tubulin是装载控制装置。褶皱的变化金融服务提供商1,SCA公司1，和身份证件1个标准化的微管蛋白通过密度扫描进行定量。这些工作分解结构这些数据代表了三个独立的观测结果。

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图6
图6。荷兰皇家空军4直接调节一些End机器翻译标记表达式
  1. A类

    qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应（左侧面板）和工作分解结构（右侧面板）分析荷兰皇家空军培养肺中4个重量和荷兰皇家空军4KO EC公司第条。qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应数据表示平均值±标准偏差(n个=3），褶皱变化与WT EC公司s.双尾非配对t吨进行了测试***P（P） = 0.0006.GAPDH公司装载控制在工作分解结构.这些工作分解结构这些数据代表了三个独立的观测结果。

  2. B类

    工作分解结构属于pSMAD公司1和SMAD公司1英寸重量和荷兰皇家空军4科-埃克s未经治疗或接受重组治疗BMP公司6个，持续4小时。pSMAD公司1/SMAD公司1比率标准化超过GAPDH公司通过密度扫描定量。这些工作分解结构这些数据代表了三个独立的观测结果。

  3. C类

    qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应属于Fsp1型,Sca1、，和同上在里面重量和荷兰皇家空军4KO EC公司s受刺激BMP公司6个，持续96小时。qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应数据为平均值±标准偏差(n个 = 3). 基因表达的折叠变化BMP公司6-治疗与未治疗欧盟委员会s.双尾非配对t吨进行了测试**P（P） = 0.0032, ***P（P） = 0.0007.

  4. D–F型

    中国IP（IP）分析荷兰皇家空军4对以下发起人具有约束力Fsp1型（D） ，Sca1型（E） 、和同上（F） 英寸重量和CCM（中央控制模块）1击倒对手培养的欧盟委员会s.假定的位置荷兰皇家空军在所分析基因的启动子中，用MatInspector鉴定了4个结合位点。的级别DNA标准化为输入。列为平均值±标准偏差三份代表性实验中的三份。

  5. G、 小时

    在HEK公司‐293细胞转染Fsp1型（G） 或Sca1型（H） 启动子报告质粒和空载体，荷兰皇家空军4或荷兰皇家空军4∆ZnF。在示意图中，红色方框表示荷兰皇家空军Ch验证的4个结合位点IP（IP），而灰色框表示荷兰皇家空军4个结合位点未经Ch验证IP（IP）启动子活性的折叠变化与空载体转染细胞有关。数据为平均值±标准偏差(n个 = 3). 双尾非配对t吨进行了测试****P（P） < 0.00001.

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图7
图7。如果没有CCM（中央控制模块）增加1个ERK公司5磷酸化负责荷兰皇家空军4上调和荷兰皇家空军4相关端机器翻译
  1. A类

    工作分解结构磷酸化的ERK公司5 (pERK公司5） 和总计ERK公司在新鲜分离的大脑中为5欧盟委员会s来自重量(n个=2）和国际CCM1个(n个=4）P12时来自两个不同窝的小鼠。价值工程‐PTP公司测定内皮细胞含量，以vinculin为负荷对照。pERK公司5/ERK公司5比值标准化超过长春花碱和价值工程‐PTP公司通过密度扫描定量。

  2. B类

    工作分解结构属于pERK公司5,ERK公司5，和荷兰皇家空军4在培养的肺源性WT EC公司s或者通信委员会1（siCCM（中央控制模块）1） 或控制（siCTRL键)硅核糖核酸单独处理或与两个si结合处理核糖核酸瞄准埃尔克5（siERK公司5#1,2).pERK公司5/ERK公司5表示在vinculin上归一化的比率。这些数据代表了三个独立的观察结果。

  3. C–E类

    培养肺源性疾病的治疗重量和CCM（中央控制模块）1KO EC公司s，其中5μMXMD公司8-92或车辆（72小时）。（C）工作分解结构分析pERK公司5,ERK公司5，和荷兰皇家空军4pERK公司5/ERK公司5比率的量化如（B）所示。（D） 左侧面板：评估pSMAD公司1和SMAD公司1蛋白质水平。pSMAD公司1/SMAD公司显示了在vinculin上归一化的比率。这些数据代表了三个独立的观察结果。右侧面板：qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应属于Bmp6型数据表示平均值±标准偏差(n个 = 3). 折叠变化与车辆处理有关CCM（中央控制模块）1KO EC公司s.双尾非配对t吨进行了测试**P（P） = 0.001, *P（P） = 0.01. （E） 代表工作分解结构第页，共页机器翻译标记（执行三分之一）。Tubulin是装载控制装置。

  4. F类

    qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应分析Klf4公司,甲基丙烯酸甲酯,Mef2C，和Mef2D型（左侧面板）和工作分解结构属于荷兰皇家空军培养的4个（右图）重量和CCM（中央控制模块）1KO EC公司用任一控制si处理核糖核酸（siCTRL键)或si核糖核酸直接发送到任何甲基丙烯酸甲酯（上部面板），Mef2C型（中央面板），或Mef2D型（下部面板）。qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应数据表示平均值±标准偏差(n个=3），褶皱变化与重量硅控制ECs.双尾非配对t吨进行了测试。上部面板：***P（P） = 0.0002,### P（P） = 0.0005, ****P（P）=4.09E‐05**P（P） = 0.001; 中央面板：***P（P） = 0.0005 (重量硅CRTL公司与重量硅MEF公司2C）***P（P） = 0.0006 (击倒对手硅CRTL公司与击倒对手硅MEF公司2C），### P（P） = 0.0001, ****P（P） < 0.00001, **P（P） = 0.007; 下部面板：****P（P）=5.6E‐05(重量硅CRTL公司与重量硅MEF公司2D）****P（P）=1.53E‐05(击倒对手硅CRTL公司与击倒对手硅MEF公司2D），#### P（P）=3.1E‐05。对于工作分解结构，长春花碱被用作负荷控制，数据代表了三个独立的观察结果。

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图8
图8。MEKK公司3‐甲乙酮依赖于5ERK公司5磷酸化负责荷兰皇家空军4上调

  1. 左侧面板：工作分解结构分析pERK公司5,ERK公司5,荷兰皇家空军4，和MEKK公司3英寸重量和CCM（中央控制模块）1KO EC公司用两种不同的硅处理核糖核酸s反对Mekk3公司（siMEKK公司3#1和siMEKK公司3#2）或控制序列（siCTRL键). 两者都有pERK公司5/ERK公司5比率和荷兰皇家空军用密度扫描法对4个归一化过vinculin的量进行定量。工作分解结构结果代表了三个独立的观察结果。右侧面板：qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应属于Klf4公司在里面重量和CCM（中央控制模块）1KO EC公司用两种不同的硅处理核糖核酸s定向到Mekk3公司（si）MEKK公司3#1和siMEKK公司3#2）或控制序列（siCTRL键).qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应结果显示为平均值±标准偏差(n个=3），褶皱变化与si有关CTRL键‐经过处理WT EC公司s.双尾非配对t吨进行了测试***P（P） = 0.0002, **P（P） = 0.002, ****P（P）=2.5E‐05，#### P（P）=3.1E‐05，### P（P） = 0.0007.

  2. 工作分解结构分析pERK公司5,ERK公司5,千磅/平方英尺4，和甲乙酮5（左侧面板）和qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应属于Klf4公司（右侧面板）英寸重量和CCM（中央控制模块）1KO EC公司用si处理的s核糖核酸反对甲乙酮5或控制序列（siCTRL键)量化如（A）所示**P（P） = 0.0035, ****P（P） < 0.00001,#### P（P）=3.5E‐05。

  3. 工作分解结构分析pERK公司5,ERK公司5，以及荷兰皇家空军4（上面板）和qRT（定量放射治疗）——聚合酶链反应属于Klf4公司（下面板）英寸重量和CCM（中央控制模块）1KO EC公司s经过处理BIX公司‐02189或车辆48小时，量化如（A）所示。折叠变化与车辆处理有关WT EC公司s.双尾非配对t吨进行了测试***P（P） = 0.0002, ****P（P）=2.1E‐05。

  4. 的示意模型荷兰皇家空军CCM发病过程中的活动和调节。

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中的注释

  • 当内皮细胞游荡时。
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