Mutually Exclusive Roles of SHARPIN in Integrin Inactivation and NF-κB Signaling

doi:10.1371/journal.pone.0143423

.2015年11月23日；10（11）：e0143423。

doi:10.1371/journal.pone.0143423。 2015年电子收集。

SHARPIN在整合素失活和NF-κB信号转导中的互斥作用

附属公司

¹芬兰图尔库图尔库大学图尔库生物技术中心。
²医学生物技术，芬兰VTT技术研究中心，芬兰图尔库。
^三英国伦敦国王学院盖伊校区细胞和分子生物物理学Randall分部。
⁴芬兰坦佩雷科技大学物理系。
⁵MEMPHYS-丹麦欧登塞南丹麦大学生物膜物理中心。
⁶芬兰图尔库图尔库大学MediCity研究实验室。
⁷芬兰图尔库大学医学微生物学和免疫学系。
⁸芬兰图尔库大学生物化学和食品化学系。

PMID： 26600301
预防性维修识别码：项目经理4658161
内政部： 10.1371/新闻稿.0143423

SHARPIN在整合素失活和NF-κB信号转导中的互斥作用

尼古拉·德·弗朗西斯基等。公共科学图书馆一号. 2015.

.2015年11月23日；10（11）：e0143423。

doi:10.1371/journal.pone.0143423。 2015年电子收集。

附属公司

¹芬兰图尔库图尔库大学图尔库生物技术中心。
²医学生物技术，芬兰VTT技术研究中心，芬兰图尔库。
^三兰德尔细胞和分子生物物理学系，伦敦国王学院盖伊校区，英国伦敦。
⁴芬兰坦佩雷科技大学物理系。
⁵MEMPHYS-丹麦欧登塞南丹麦大学生物膜物理中心。
⁶芬兰图尔库图尔库大学MediCity研究实验室。
⁷芬兰图尔库大学医学微生物学和免疫学系。
⁸芬兰图尔库大学生物化学和食品化学系。

PMID： 26600301
预防性维修识别码：项目经理4658161
内政部： 10.1371/新闻稿.0143423

摘要

SHANK相关的RH域相互作用子（SHARPIN）通过与整合素α亚基的相互作用抑制整合素。此外，SHARPIN作为线性泛素链组装复合物（LUBAC）的组成部分，增强了核因子κB（NF-κB）的活性。然而，目前尚不清楚如何协调这些看似不同的角色的监管。这里，我们证明SHARPIN以互斥的方式结合整合素和LUBAC。我们将SHARPIN上的整合素结合位点映射到泛素样（UBL）结构域，该结构域与SHARPIN与LUBAC成分RNF31（指环蛋白31）的相互作用有关，并确定整合素和RNF31调节所需的两个SHARPIN残基（V267，L276）。因此，整合素α-尾在体外能够与RNF31竞争SHARPIN结合。重要的是，完整的SHARPIN RNF31-结合位点包含对SHARPIN-integrin相互作用不必要的残基（F263A/I272A）。重要的是，破坏SHARPIN与整合素或RNF31的相互作用分别消除了SHARPIN介导的整合素或NF-κB活性的调节。总之，这些数据表明SHARPIN在抑制整合素活性和支持线性泛素化方面的作用是（分子上）不同的。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。SHARPIN的UBL域介导与整合素的结合。**
（A） SHARPIN及其功能域的示意图表示和本研究中使用的SHARPIN片段。（B）下拉实验以确定GFP-SHARPIN（全长或片段）与对应于ITGAL和ITGB2细胞质域的肽之间的相互作用。（C） GST-SHARPIN（全长或片段）与全长ITGAL-ITGB2或ITGAL-IGB2结合的Far-Western分析缺少两个细胞质尾部。显示GST-SHARPIN（全长或片段）和ITGAL-ITGB2的加载控件。（D） GST-SHARPIN（全长或片段）与ITGA2胞质尾部保守结构域对应的整合素肽结合的荧光偏振滴定法。显示了平均归一化结合曲线（平均值±s.e.m.***：p<0.001）。

**图2。使用SHARPIN UBL域模型设计SHARPIN变体。**
（A） SHARPIN UBL域模型主干（紫色）与HOIL1L的UBL域（绿色，PDB登录代码：4DBG）的叠加。（B） SHARPIN UBL模型的曲面表示。表面根据从浅到深紫色的残余疏水性进行颜色编码。本研究中突变的残基足迹显示为绿色轮廓。（C）不同物种之间SHARPIN UBL域的部分对齐。本研究中突变的保守残基用红色表示。

**图3。SHARPIN整合素结合位点的精细定位。**
（A）使用Far-Western分析测定了不同GST-SHARPIN（WT和所有点突变）与全长ITGAL-ITGB2的相互作用。GST-SHARPIN公司^1-180作为阴性对照。（B） FLIM对过度表达WT或突变GFP-SHARPIN并结合ITGA5–mCherry的HEK293癌细胞进行FRET分析。荧光寿命，映射细胞中的空间FRET，使用伪彩色标尺描述（蓝色，正常寿命；红色，FRET（缩短寿命））。比例尺：10μm。（C）量化所有突变体（n≥12个细胞）的FRET效率。所有数值数据均为平均值±标准偏差***：p<0.001，*：p<0,05。

**图4。V267和L276残基对SHARPIN介导的整合素抑制至关重要。**
（A） FACS分析CHO细胞过度表达GFP单独或WT或突变GFP-SHARPIN，以及RFP-TALIN头部。整合素激活指数是通过将活性细胞表面整合素水平（在EDTA存在下FN7-10结合减去FN7-10结合）除以总细胞表面整合素水平（Mb1.2染色减去单独的第二抗体）来计算的（n＝3）。（B）迁移速度的量化*氯丁橡胶*MEF仅过度表达GFP或GFP-SHARPIN^重量50μg/ml胶原蛋白（分别为78和83个细胞）。（C，D）迁移速度的量化（n=27–125个细胞）（C），以及*氯丁橡胶*MEF在50μg/ml胶原蛋白上过度表达WT或突变GFP-SHARPIN。所有数值数据均为平均值±标准偏差***：p<0.001，*：p<0.05。

**图5。SHARPIN中RNF31结合位点的精细定位。**
（A）对照组或SHARPIN-silenced PC3细胞中SHARPIN和β-微管蛋白水平的Western blot分析。（B）使用荧光素酶报告试验测定SHARPIN或对照PC3细胞的TNF诱导的NF-κB启动子活性。（n=3，每个重复5次）。（C） TNF诱导SHARPIN-silenced PC3细胞的NF-κB启动子活性，仅表达GFP、WT或突变GFP-SHARPIN（2-3次实验中的n=6-15次测量）。（D，E）RNF31与WT或突变GST-SHARPIN之间的相互作用通过基于ELISA的结合分析（n=3）（D）或Far-Western分析（E）确定。所有数值数据均为平均值±标准偏差***：p<0.001，**:p<0.01，*:p<0.05。

**图6。与SHARPIN绑定的整合素和RNF31是互斥的。**
（A）下拉分析显示，对应于ITGAL细胞质结构域的肽的存在阻止了GST-SHARPIN和RNF31之间的相互作用。（B）从Jurkat细胞共免疫沉淀内源性SHARPIN、RNF31和ITGAL（GFP抗体用作阴性对照）。（C）从HEK293细胞中提取GFP-SHARPIN表明，悬浮细胞与贴壁细胞相比RNF31-SHARPIN相互作用降低（n=4）。RNF31结合被标准化为总RNF31水平和下拉GFP-SHARPIN的量。（D）使用荧光素酶报告分析（n=2，每个重复5次）测量粘附于5μg/ml纤维连接蛋白或聚赖氨酸（整合素非依赖性细胞粘附的基质）的PC3细胞的TNF诱导的NF-κB启动子活性。（E）用荧光素酶报告试验（n=2个重复6-9次，n=3个重复3-5次）测量TNF-诱导的PC3细胞或WT-MEF的NF-κB启动子活性，PC3细胞和WT-MEFs与膜透性ITGA1-尾肽（α1-TAT）或搅乱肽（ScrTAT）孵育。所有数值数据均为平均值±标准偏差***：p<0.001，**:p<0.01，*:p<0.05。

**图7。SHARPIN函数的当前模型。**
（A） SHARPIN通过与α-整合素细胞质域结合并阻止整合素激活物TALIN的结合来抑制整合素的激活。此外，SHARPIN是LUBAC的一部分，LUBAC是激活典型NF-κB通路所必需的。我们现在证明整合素和RNF31结合是互斥的，因为它们是由SHARPIN UBL域中部分重叠的结合位点介导的。（B） SHARPIN相互作用概述以及这些相互作用如何影响不同的信号通路。SHARPIN与其功能域（N端PH域、中心UBL域和C端NZF域）进行了示意性描述。UBL结构域是一个多方面的蛋白质相互作用枢纽，已被证明与许多蛋白质相互作用，以黄色条突出显示。这些相互作用都有特定的功能后果，以绿色条突出显示。此外，SHARPIN的N端PH结构域介导SHARPIN同二聚体化，而LUBAC功能需要C端NZF结构域。

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