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.2015年11月24:5:17046。
doi:10.1038/srep17046。

PRL-3在肿瘤进展中激活mTORC1

附属公司

PRL-3在肿瘤进展中激活mTORC1

祖晔等。 科学代表. .

摘要

众所周知,PRL-3是一种转移相关磷酸酶,通过激活PI3K/Akt发挥其致癌功能,PI3K/Akt是雷帕霉素敏感mTOR复合物1(mTORC1)的关键调节因子,但PRL-3与mTOR激活之间的关联尚未得到正式证明。我们报告了临床肿瘤样本和小鼠肿瘤模型中PRL-3表达与mTOR磷酸化激活之间的正相关,并证明PRL-3通过抑制TSC2增加PI3K/Akt介导的Rheb-GTP激活,从而增加mTOR底物p70S6K和4E-BP1的下游信号。我们还表明,PRL-3通过增加mTOR与Rag GTPases的结合亲和力,以Akt非依赖性的方式增加mTOR向溶酶体的易位,这证明了之前未描述的PRL-3的作用机制。PRL-3还通过激活mTOR增强了基质金属蛋白酶-2的分泌和细胞侵袭性,而mTOR对雷帕霉素治疗敏感。即使在环境应激条件下,PRL-3的下游效应也保持不变,这表明PRL-3通过其对mTOR的影响为肿瘤细胞提供了战略生存优势。

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数字

图1
图1。PRL-3表达与mTOR活性呈正相关体内在体外.
()PRL-3阳性癌症患者配对肿瘤正常组织的免疫印迹。计算磷酸化/总4E-BP1带密度的比率,并将其归一化为通道1中的磷酸化/总4E-BPl比率。星号患者肿瘤样本中4E-BP1过度磷酸化与PRL-3表达相关。(b)在自发性肿瘤发展过程中对正常和MMTV-PyMT乳腺组织进行免疫印迹。顶部面板6至15周龄的正常小鼠(N)或转基因MMTV-PyMT小鼠(T)的图像。中间面板,小鼠切除乳房组织的代表性图像。所有图片均由图拉·敏拍摄。蓝色虚线,MMTV PyMT小鼠中可触及的乳腺肿瘤的总大小。下部面板PRL-3表达与4E-BP1和mTOR磷酸化之间的相关性。(c–d码)在一组9个人类肿瘤细胞系中,仅EGFP载体(Vec)、EGFP标记的野生型PRL-3(PRL-3)或EGFP标签的催化非活性PRL-3的过度表达。PRL-3上调mTOR磷酸化(c(c))HCT116、HeLa、MCF7、HCT15、LOVO和SW620细胞,但不在(d日)G361、DLD1或A2780单元。GAPDH起到了装载控制的作用。计算磷酸化/总mTOR带密度的比率,并将其归一化为通道1中的磷酸化/总mTOR比率。补充信息中提供了此处显示的裁剪图像的完整免疫印迹。
图2
图2。PRL-3驱动的mTOR激活与Akt-TSC2-Rheb信号增加相关。
()仅过度表达EGFP载体(Vec)、EGFP标记的野生型PRL-3(PRL-3)或EGFP标签的催化非活性PRL-3 C104S(C104S)的HCT116细胞培养24小时在正常氧(Ctrl)、缺氧(Hx)或无血清(SF)条件下在全培养基中培养h,然后用所示抗体进行裂解和western blot分析。(b)将过表达Vec、PRL-3或C104S的HCT116细胞培养1分析前,在正常氧(Ctrl)或氨基酸缺乏(AA-)条件下,在全培养基中培养h(). (c(c))稳定表达抗PRL-3 shRNA的HCT116细胞(shPRL-3型)或对照shRNA(shCon)培养并分析(). (d日)细胞裂解物来自()用构型特异性抗Rheb-GTP抗体进行免疫沉淀,并用所示抗体进行免疫印迹分析。(e(电子))细胞裂解物来自(b)被分析为(d日). ((f))PRL-3到mTOR底物4EBP1和p70S6K的拟议信号通路。补充信息中提供了此处显示的裁剪图像的代表性全免疫印迹。
图3
图3。Akt活性是PRL-3介导的mTOR信号过度激活所必需的。
()稳定表达EGFP(Vec)或EGFP-PRL-3(PRL-3)的HCT116细胞中的Akt使用打乱的小干扰RNA(siRNA;siCon)或Akt-靶向siRNA(siConAKT公司)培养48小时在分析Akt-mTOR途径活性前h。计算Akt、4E-BP1和p70S6K的磷酸化/总带密度的比率,并将其标准化为泳道3中的同源磷酸化/总蛋白比率。(b)HCT116 Vec或PRL-3细胞中的Akt被抑制30在分析Akt-mTOR途径活性之前,使用Akt抑制剂VIII(AktiVIII)(). 计算Akt、4E-BP1和p70S6K的磷酸化/总带密度比率,并将其归一化为车道3中的同源磷酸化/全蛋白比率。此处提供的裁剪图像的完整免疫印迹在补充信息中提供。
图4
图4。PRL-3以Akt非依赖性方式促进溶酶体mTOR的重定位和积累。
()在全培养基(Ctrl)或氨基酸饥饿培养基(AA-)中过度表达EGFP载体(Vec)或EGFP标记的野生型PRL-3(PRL-3)的HCT116细胞中mTOR和LAMP2的免疫荧光分析。使用了针对人类LAMP2和mTOR的抗体。红色,mTOR信号;绿色、LAMP2信号;合并合并了mTOR、LAMP2和DNA(DAPI)信号。比例尺, 10微米。每个合并面板中的缩放区域可以更好地可视化mTOR/LAMP2协同定位。(b)HCT116细胞稳定表达针对PRL-3的小发夹RNA(shRNA)PRL-3型)或对照shRNA(shCon)培养并分析().比例尺, 10微米。(c(c))用二甲基亚砜或Akt抑制剂VIII(AktiVIII)处理HCT116 Vec或PRL-3细胞30min,并使用抗mTOR和LAMP2抗体进行双重免疫荧光分析。红色,mTOR信号;绿色,灯2比例尺, 10微米。
图5
图5。PRL-3通过增加Rag GTPase结合促进溶酶体mTOR的积累和激活。
()HCT116-EGFP(Vec)或HCT116-GGFP-PRL-3(PRL-3)细胞与GST-RagB/C共转染,并在常压(Nx,24h) ,缺氧(Hx,24h) ,无血清(SF,24h) 或氨基酸缺乏(AA-,1h) GST下拉前的条件和免疫印迹分析。顶部面板,GST富集馏分;底部面板,总蛋白质输入。(b)HCT116细胞稳定表达针对PRL-3的小发夹RNA(shRNA)PRL-3型)或对照shRNA(shCon)培养并分析(). (c(c))HCT116-EGFP(Vec)和HCT116-GGFP-PRL-3(PRL-3)细胞过度表达显性阴性RagB的免疫印迹T54升-碎布DQ121L问题(拉格DN(公称直径))或矢量控制(Ctrl)。(d日)用空载体(Ctrl)或显性阴性RagB转染HCT116-Vec或HCT116-PRL-3细胞T54升-拉格DQ121L问题(拉格DN(公称直径))24小时h、 或缺乏氨基酸1h、 在使用抗mTOR和LAMP2抗体进行双重免疫荧光分析之前。mTOR/LAMP2信号的曼德斯系数(共定位分数)在面板i-vi的右下角给出。红色,mTOR信号;绿色,灯2。比例尺, 10微米。补充信息中提供了此处显示的裁剪图像的完整免疫印迹。
图6
图6。PRL-3以雷帕霉素敏感的方式促进癌细胞运动、侵袭性和MMP-2分泌。
()HCT116-EGFP(Vec)或HCT116-GGFP-PRL-3(PRL-3)细胞的单层受到“损伤”,并监测48个以上有无100时为hnM雷帕霉素(Rapa)。虚线,伤口两侧细胞单层的边界。比例尺,100微米。(b)通过基底基质培养的HCT116-EGFP(Vec)或HCT116-GGFP-PRL-3(PRL-3nM雷帕霉素。结果表示为平均值±S.D;***第页 = 5.988E-05。(c(c))HCT116-EGFP(Vec)或HCT116-GGFP-PRL-3(PRL-3)细胞在有或无100nM雷帕霉素24采集h,浓缩,免疫印迹分析。TCL公司,来自匹配细胞培养物的总细胞裂解物。(d日)大肠癌患者队列GSE40967的Kaplan-Meier分析(n个 = 557)通过低或高PRL-3表达分层。补充信息中提供了此处显示的裁剪图像的完整免疫印迹。
图7
图7。mTORC1的PRL-3激活的建议模型。
PRL-3通过(1)Akt/TSC2/Rheb过度激活和(2)增强与Rag GTP酶的结合和溶酶体募集来激活mTORC1活性。PRL-3驱动的mTOR激活最终导致癌细胞运动、侵袭和MMP-2分泌增加。

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引用人

工具书类

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