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.2015年11月20日；11（11）：e1005274。
doi:10.1371/journal.ppat.1005274。 eCollection 2015年11月。

Hsp70等位基因对卡波西肉瘤相关疱疹病毒复制和转录区的形成至关重要

贝琳达·巴奎罗·佩雷斯 1, 阿德里安·怀特豪斯 1
附属公司

Hsp70等位基因对卡波西肉瘤相关疱疹病毒复制和转录区的形成至关重要

贝琳达·巴奎罗·佩雷斯等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）是一种与多种AIDS相关恶性肿瘤相关的致癌疱疹病毒。与其他疱疹病毒一样，KSHV裂解复制所需的多种过程，包括病毒转录、病毒DNA合成和衣壳组装，发生在病毒诱导的核内结构中，称为复制和转录室（RTC）。在这里，我们利用一种新的方法，结合亚细胞分馏和定量蛋白质组学，来识别KSHV诱导的RTC中招募的细胞蛋白，从而在KSHV裂解复制中发挥关键作用。我们发现HSP70伴侣蛋白家族的几个亚型，Hsc70和iHsp70，从细胞质重新分布到细胞核，与KSHV诱导的RTC的初始形成一致。我们证明，核伴侣病灶是动态的，最初形成于新形成的KSHV RTC附近，但在以后的时间点，伴侣在KSHV RT C内移动，并与活跃复制的病毒DNA完全共存。还使用特异性Hsp70亚型小分子抑制剂VER-155008检测了Hsp70异构体在KSHV RTC中的功能意义。有趣的是，研究结果强调了Hsp70亚型在KSHV复制周期中的重要作用，该复制周期与蛋白质的稳定性和成熟无关。值得注意的是，抑制Hsp70亚型可以阻止KSHV RTC的形成和RNA聚合酶II（RNAPII）重新定位到病毒基因组，从而导致KSHV的全局转录和随后的病毒蛋白合成及DNA复制被取消。这些新发现揭示了调节KSHV裂解复制的新机制，并突出了HSP70抑制剂作为新型抗病毒药物的潜力。

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利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。在HEK-293T rKSHV.219细胞中成功富集核膜区和相关KSHV RTC。
Western blotting证实，在未激活（-）和再激活48小时（+）的HEK-293T rKSHV.219细胞中成功富集NE区域。使用从全细胞（WC）和核膜（NE）组分中提取的等量总蛋白。单克隆抗体Mab414特异性识别大量核孔蛋白（Nups）中存在的苯丙氨酸-甘氨酸（FG）重复序列基序。闭合箭头指向仅在NE富集后由MAb414检测到的Nup。开放箭头指向NE富集过程中丢失的核孔蛋白。与WC组分相比，NE组分中的几个FG Nup以及Nup160、组蛋白H3和层粘连蛋白B1均显著富集。NEs组分中核仁蛋白B-23和C-23以及细胞质GAPDH蛋白均减少，表明亚细胞分馏正确。病毒RTC相关的ORF57和RTA蛋白用于监测裂解再激活和评估RTC富集。ORF57抗体检测到全长ORF57蛋白（FL-ORF57）和半胱天冬酶-7裂解ORF57（CL-ORF58）。
图2
图2。Hsc70从细胞质重新分布到KSHV诱导的RTC的外围和内部。
（A） 未激活的TREx BCBL1-RTA细胞显示内源性Hsc70蛋白均匀分布在细胞质和细胞核之间（i）。在RTC形成前12小时再激活时，当RTA在细胞核内扩散时，也可以看到相同的Hsc70位置（ii）。在20小时重新激活时，病毒RTA被组装成早期RTC。在细胞质中未检测到Hsc70，而是发现了大量主要位于RTC附近的核病灶（iii）。在随后的再激活时间，RTC内完全招募到非常大的Hsc70病灶。显示Hsc70细胞质缺失（iv箭头）。以黄色突出显示的细胞核显示了一个典型的KSHV完全发育的RTC，细胞染色质边缘化到核外围。（B） 将未活化（-）或活化26小时（+）的TREx BCBL1-RTA细胞分为全细胞（WC）、细胞质（C）和细胞核（N）部分。通过Western blotting分析每个组分中等量的总蛋白。核组分的特征是层粘连蛋白B1的富集和细胞质GAPDH的缺失，而细胞质组分则表现出相反的特征。在重新激活的细胞中检测到细胞质Hsc70的少量减少，与细胞核Hsc70少量增加相关，进一步支持了Hsc70从细胞质重新分布到细胞核。（C） TREx BCBL1-RTA细胞保持未激活状态（i）或重新激活24小时（ii-iiii'），然后用RTA和Hsc70以及Click-iT EdU Alexa Fluor 647特异性抗体进行三重标记，后者允许显示新合成的DNA。在早期激活期间，Hsc70蛋白的一部分与小病毒RTC相邻。箭头指向一个充满病毒DNA的小KSHV RTC（ii）。Hsc70在小RTC中也与病毒DNA（ii）和RTA（ii’）部分共定位。在随后的再激活时间内，Hsc70完全在完全发育的RTC内移动，与病毒DNA（iii）和RTA（iii’）强共定位。
图3
图3。VER-155008消除了TREx BCBL1-RTA细胞中预先翻译的病毒蛋白合成。
（A） 在未激活细胞中评估VER-155008的细胞毒性，将其暴露在不断增加的抑制剂浓度下24小时。（i）细胞代谢活性以剂量依赖性的方式降低，如使用MTS分析定量的那样。（ii）在VER-155008存在的情况下，观察到全长（FL）PARP1蛋白被剂量依赖性地裂解为裂解的（CL）PARP1。（B） 将未激活的细胞暴露于不断增加的抑制剂浓度下24小时。通过ApoTox-Glo Triplex分析定量证明，浓度高于3μM会导致效应caspases-3/7的细胞毒性和活化增加。（C） 免疫印迹分析显示，用非细胞毒性抑制剂浓度（1至2.5μM）处理24小时的重新激活细胞显示，与DMSO处理的样品相比，病毒蛋白减少，而细胞蛋白不受影响。RNAPIIo表示低磷酸化RNAPII。Ser5和Ser2 RNAPII分别表示丝氨酸5-和丝氨酸2-超磷酸化RNAPII形式。（D） 细胞被重新激活24小时，以产生强大的病毒蛋白。然后，以50μg/ml的速度将二甲基亚砜对照物（0.1%）或VER-155008与环己酰亚胺（CHX）一起添加到嵌段物中从头开始蛋白质合成。在CHX添加后（0、4、8、16和24 h）收集多次蛋白裂解物，并通过Western blotting进行分析。VER-155008没有改变RTA或ORF57蛋白的半衰期，因此这些蛋白不是Hsp70亚型的客户。
图4
图4。VER-155008消除了HEK-293T rKSHV.219细胞中预先翻译的病毒蛋白合成。
（A） 在未激活细胞中评估VER-155008的细胞毒性，将其暴露在不断增加的抑制剂浓度下24小时。（i）细胞代谢活性以剂量依赖性的方式降低，如使用MTS分析定量的那样。（ii）VER-155008治疗不易引起PARP1的caspase 3依赖性分裂。仅在80μM时观察到微弱的PARP1裂解（CL）。（B） 将未激活的细胞暴露于不断增加的抑制剂浓度下24小时。在抑制剂存在的情况下，代谢活性细胞数量减少，但细胞毒性没有增加。即使在存在60μM VER-155008的情况下，也没有激活效应半胱天冬酶。这种表型与细胞周期阻滞相一致。结果通过ApoTox-Glo Triplex分析进行量化。（C） 免疫印迹分析表明，与DMSO处理的样品相比，用40μM VER-155008处理24小时的活化细胞导致病毒蛋白的消除，而细胞蛋白保持不变。（D） 将细胞重新激活24小时，以允许强大的病毒蛋白表达。然后，以100μg/ml的速度将二甲基亚砜对照物（0.1%）或VER-155008与环己酰亚胺（CHX）一起添加到嵌段物中从头开始蛋白质合成。在CHX添加后（0、4、8、16和24小时）收集蛋白裂解物，并进行蛋白质印迹。如之前在TREx BCBL1-RTA细胞中所见，VER-155008没有改变RTA或ORF57蛋白的半衰期。
图5
图5。VER-155008导致TREx BCBL1-RTA细胞中病毒转录物、病毒DNA和子代的显著减少。
（A） 在对照二甲基亚砜（0.1%）或一系列增加的抑制剂浓度存在下，将细胞重新激活24小时，分离总RNA并进行qRT-PCR。早（橙色）、晚（红色）和ori-Lyt公司与DMSO处理的样品中发现的水平相比，在1μM VER-155008时，病毒转录物都显著降低。所有样品均归一化至GAPDH公司结果显示了三个生物重复的平均值，以误差条为标准偏差。（B） 的稳定性GAPDH公司在存在转录抑制剂放线菌素D（AcD）（2.5μg/ml）或对照DMSO（0.25%）的情况下，在未激活的TREx BCBL1-RTA细胞中评估转录物。在指定的时间点收集细胞，提取总RNA，然后进行qRT-PCR。AcD治疗6小时后GAPDH公司成绩单减少了一半以上（C吨=18.09）与DMSO处理的细胞（C吨= 16.24). 治疗8小时后，观察到进一步减少（C吨= 19.68). 显示了以误差条为标准差的两个生物重复的平均值。（C） 金额GAPDH公司与二甲基亚砜处理的样品相比，在浓度低于3μM的条件下使用VER-155008 24小时，转录物没有显著减少。相反，高于3μM的浓度显著显示C吨低于DMSO样品，表明在这些抑制剂浓度下细胞转录受到影响。使用病毒转录物定量的相同样本绘制所有C吨值。结果显示了三个生物重复的平均值，以误差条为标准偏差。（D） 将细胞重新激活72 h，分离总DNA并进行实时qPCR。病毒DNA载量在2μM VER-155008时显著降低。结果显示了三个生物重复的平均值，以误差条为标准偏差。（E） 在2.5μM的VER-155008或载药二甲基亚砜（0.1%）存在下，TREx BCBL1-RTA细胞被重新激活72小时。然后将培养基与HEK-293T细胞孵育24 h，然后提取总RNA和qRT-PCR。抑制处理细胞中的病毒子代显著减少。结果显示了三个生物重复的平均值，以误差条为标准偏差。
图6
图6。VER-155008导致HEK-293T rKSHV.219细胞中病毒转录物显著减少。
（A） 在对照二甲基亚砜（0.1%）或一系列增加的抑制剂浓度存在下，细胞被重新激活24小时。通过RT-PCR对早期（蓝色）、早期（橙色）、晚期（红色）和ori-Lyt公司病毒转录物显示，与DMSO处理的样品中发现的水平相比，在25μM VER-155008时，所有转录物都显著降低。所有样品均归一化至GAPDH公司结果显示了三个生物重复的平均值，以误差条为标准偏差。（B-D）细胞的稳定性GAPDH公司,SRAG公司和过氧化氢.1在HEK-293T rKSHV.219细胞中使用放线菌素D（AcD）（10μg/ml）或对照二甲基亚砜（1%）进行mRNA衰变分析，测定转录物。在指定的时间点收集细胞，提取总RNA，然后进行qRT-PCR。显示了以误差条为标准差的两个生物重复的平均值。（B）GAPDH公司转录本非常稳定，在AcD治疗10小时后其水平没有显著降低。（C） 4小时AcD治疗SRAG公司mRNA水平降低了50%，显示出相对较短的稳定性。（D）过氧化氢.1信使核糖核酸水平非常不稳定，在AcD治疗2小时后减少了近100%。（E）GAPDH公司在24小时VER-155008处理后，重新激活的HEK-293T rKSHV.219细胞的转录水平保持不变。使用病毒转录物定量的相同样本绘制所有C吨值。（F） 不稳定的细胞SRAG公司和过氧化氢.1与DMSO处理24小时相比，VER-155008处理的mRNAs没有显著降低，这表明即使在高浓度VER-155009下，细胞转录也没有受到影响。病毒转录物被量化的相同样本被用于量化SRAG公司和过氧化氢.1.所有样品均归一化至GAPDH公司.
图7
图7。RTA介导的KSHV启动子反式激活不需要Hsp70亚型。
（A） 用对照pEGFP或pRTA-EGFP瞬时转染HEK-293T细胞。使用GFP特异性抗体进行转染后24小时免疫沉淀（IP）。内源性Hsc70与EGFP-RTA相互作用，但不与对照蛋白EGFP相互作用。（B） 用对照pEGFP或pRTA-EGFP转染HEK-293T细胞24 h，然后进行免疫荧光分析。内源性Hsc70是表达EGFP（i）的细胞中的细胞质。相反，Hsc70在细胞核中与EGFP-RTA强烈共定位，但在核仁中没有（ii）。（C） 用对照pEGFP或pRTA-EGFP瞬时转染HEK-293T细胞。转染24小时后，添加VER-155008并再孵育24小时。然后，使用GFP特异性抗体进行免疫沉淀。即使在存在55μM VER-155008的情况下，Hsc70和EGFP-RTA之间的相互作用也没有被破坏。（D） HEK-293T细胞与pRTA-EGFP和雷尼利亚荧光素酶载体和ORF57型启动子萤火虫荧光素酶报告载体或空报告载体（pGL3-BASIC）。使用pEGFP作为阴性对照蛋白进行相同的联合转染。转染后24小时，细胞暴露于VER-155008 2小时，并测定荧光素酶活性。RTA-responsive的类似激活ORF57型DMSO处理细胞的启动子出现在55μM VER-155008处理的细胞中。三个独立转染的结果以误差条作为标准偏差进行平均。（E） 用pPAN-WT和pRTA-EGFP或对照pEGFP瞬时共转染HEK-293T细胞。转染24小时后，添加载体药物DMSO（0.1%）或45μM VER-155008，并再培养24小时。然后提取总RNA并进行qRT-PCR。RTA介导的启动子反式激活和随后的合成聚丙烯腈在存在VER-155008或对照DMSO的情况下，RNA的发生率相似。三个独立转染的结果以误差条作为标准偏差进行平均。（F） 的稳定性聚丙烯腈在已经用pPAN WT和pRTA EGFP共转染的HEK-293T细胞中测定RNA。转染24小时后，添加放线菌素D（AcD）（5μg/ml）或DMSO对照（0.5%）。在指定的时间点收集细胞，提取总RNA，然后进行qRT-PCR。显示了以误差条为标准差的两个生物重复的平均值。
图8
图8。抑制Hsp70亚型可阻止Hsc70伴侣对KSHV RTC的募集和RTC的形成。
（A） TREx BCBL1-RTA细胞被重新激活，并用对照DMSO（0.1%）处理24小时。在DMSO处理的细胞中形成了多个经RTA标记的KSHV RTC，其中招募了大量Hsc70病灶。在这些细胞中，Hsc70从细胞质中消失。（A’）使用蔡司Zen 2011软件对共焦图像进行轮廓分析。在40倍物镜拍摄的两幅具有代表性的共焦图像中，对每个细胞进行轮廓分析；这包括对总共49个DMSO处理的细胞进行分析。对于DMSO处理的再激活细胞，显示了代表性的线条轮廓（黄线）以及沿着线条的每个像素处每个通道的相对强度。DAPI强度剖面显示，核边界外的值低于25。RTA剖面显示强度为160的峰值，位于对应于KSHV复制室的DAPI边界内。Hsc70峰位于DAPI边界内，表明其核位置。Hsc70强度峰值与RTA强度峰值极为相似（箭头），表明Hsc70与RTA共存，因为这两个峰值都出现在沿线的同一位置。（B） 在重新激活并用2μM VER-155008处理24小时的细胞中，RTA在细胞核中扩散，未组装成KSHV RTC。此外，与DMSO处理的细胞相比，Hsc70核病灶较小且数量较少，并且Hsc70没有从细胞质中耗尽。（B’）。在40倍物镜拍摄的两个代表性共焦图像中，对每个细胞进行共焦分析；总共分析了68个抑制剂处理的细胞。抑制剂处理细胞的代表性线条轮廓（黄线）如图所示。DAPI边界外可见Hsc70峰，对应于Hsc70细胞质峰（星号）。（C） 对于每个共聚焦图像和实验条件，将每个细胞的总Hsc70峰和总核Hsc70峰值结合起来。数据被转换为细胞核和细胞质峰的百分比。根据这个平均百分比，计算平均值的标准误差。（D） 在存在或不存在2μM VER-155008的情况下，将活化的TREx BCBL1-RTA细胞分离为全细胞（WC）、细胞质（C）和核（N）组分。通过Western blotting分析每个组分中等量的总蛋白。在抑制剂处理的细胞中检测到细胞质Hsc70轻微增加，与核Hsc70的轻微减少相关。（E） 通过计算所有细胞和在40倍物镜下拍摄的6张代表性共焦图像中出现的相应组装RTC，计算24小时内2μM VER-155008存在和不存在时组装RTC的百分比。在DMSO处理的细胞中共有227个细胞，在抑制剂处理的细胞内共有260个细胞。DMSO处理的细胞有~44%的组装RTC，相比之下，只有VER-155008存在~13%的细胞呈现发育良好的RTC。
图9
图9。抑制Hsp70亚型可减少RNAPII向KSHV RTC的迁移。
（A） TREx BCBL1-RTA细胞保持未激活状态，并用对照DMSO（0.1%）（i）或2μM VER-155008（ii）处理。使用抗RTA的多克隆抗体和抗RNAPII的单克隆抗体（CTD4H8）进行免疫荧光分析。RNAPII蛋白是核蛋白，不包括核仁（箭头），无论是否使用抑制剂。（B） TREx BCBL1-RTA细胞被重新激活，并用对照DMSO（0.1%）或2μM VER-155008处理24小时。在DMSO处理的细胞中，RNAPII和RTA被招募到病毒RTC中（i箭头）而在抑制剂处理的细胞中，RTA在细胞核中扩散，RNAPII形成了许多小病灶，排除了核仁，类似于复制前位点（ii箭头）。（C） TREx BCBL1-RTA细胞在二甲基亚砜（0.1%）或2μM VER-155008的存在下被重新激活（R）24小时。未激活（U）细胞经二甲基亚磺酸盐（0.1%。用单克隆CTD4H8 RNAPII抗体或小鼠对照抗体（IgG）进行ChIP测定。在存在VER-155008的情况下，检测到与病毒启动子结合的RNAPII数量显著减少。三个独立实验的平均值显示为误差条作为标准偏差。
图10
图10。Hsc70的特异性缺失显著降低了HEK-293T rKSHV.219细胞中KSHV裂解转录。
用100 nM Hsc70特异性siRNA或100 nM干扰siRNA转染细胞两次。在siRNA转印后四天，细胞重新激活24小时或保持未激活状态，并从同一样品中提取总RNA和蛋白质。尽管取得了~Hsc70在mRNA水平上敲低85%（A），Hsc70 siRNA处理的样品中仍有大量Hsc70蛋白残留（B）。尽管在蛋白质水平上有这种小的敲除，但在Hsc70缺失的细胞中，RT-PCR分析（C）量化的不同时间类别的多种病毒转录物数量显著减少。Hsc70敲除后，用qPCR评估病毒DNA复制。siRNA转染后4天，细胞被重新激活72小时。在scramb和Hsc70处理的细胞（D）之间未观察到显著差异。在打乱和Hsc70处理的细胞中检测到类似的病毒粒子生成。siRNA转染四天后，细胞重新激活72 h，离心培养液，立即与HEK-293T细胞孵育24 h。然后分离总RNA并进行qRT-PCR（E）。即使在HEK-293T rKSHV.219细胞中siRNA转染7天后，Western blotting仍观察到Hsc70在蛋白水平上的不完全敲除。这表明Hsc70在该细胞系（F）中具有显著的稳定性。三个独立转染的平均值用误差条表示为标准偏差（A，C-E）。
图11
图11。HEK-293T rKSHV.219细胞中iHsp70特异性缺失后，KSHV裂解基因的大多数表达不受影响。
用100 nM iHsp70特异性siRNA或100 nM干扰siRNA两次转染细胞。在siRNA转染后4天，细胞重新激活24小时或保持未激活状态，并从同一样品中提取总RNA和蛋白质。在mRNA水平上实现了iHsp70的高效敲除(~75%）（A）和蛋白质水平（B）。少量减少克/升和聚丙烯腈在iHsp70缺失的细胞（C）中观察到转录物。三个独立变换的平均值用误差条表示为标准偏差。
图12
图12。Hsc70的耗竭消除了TREx BCBL1-RTA细胞中KSHV RTC的形成。
（A） 用scramble或Hsc70特异性siRNA与pmaxGFP一起对细胞进行核转染，以监测转染效率。用40倍物镜对核感染后48h的细胞进行荧光和光学显微镜成像。将显示合并图像。（B） 核感染后4天，分离总RNA并进行qRT-PCR。Hsc70型mRNA水平显示~相比之下，90%的击倒率iHsp70型mRNA显著增加。（C） Western blotting显示，核感染后4天，Hsc70在蛋白质水平上出现轻微缺失，而Hsc70 siRNA处理的细胞中iHsp70明显上调。（D和E）核感染后6天，重新激活细胞24小时，并用RTA和Hsc70特异性抗体进行免疫荧光。（D） 在加扰siRNA处理的细胞中，观察到Hsc70被募集到的RTC。（E） 在Hsc70 siRNA处理的细胞中，几乎或完全耗尽Hsc70蛋白的细胞没有形成RTC（白色箭头），而呈现组装RTC的细胞仍然显示Hsc70核病灶（黄色箭头）。
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