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.2015年12月；17(12):1523-35.
doi:10.1038/ncb3264。 Epub 2015年11月16日。

代谢组在人类胚胎干细胞从幼体到质体的转化过程中调节表观遗传景观

亨利克·斯珀伯 1 2 三, 朱莉·马修 1 2, 王玉良 4 5, 艾米·费雷西奥 1 2, 詹妮弗·赫森 2 6, 徐卓金 2, 卡琳·A·费舍尔 1 2, 阿里克斯·德维 1 2 7, 达米安·德特罗 1 2, 顾海伟（Haiwei Gu） 2 8, 斯蒂芬妮·L·巴特尔 2 9, 梅根·肖瓦尔特 10, 克里斯蒂娜·瓦伦西西 2 9, 杰森·比拉斯 11 12, 诺兰·G·埃里克森 11, 莉莉亚娜·玛格丽塔 2, 亚伦·M·罗比塔尔 2, 达契亚娜·马吉安图 11, 奥利弗·费恩 10 13, 大卫·霍肯贝 11, C安东尼·布劳 2 14, 丹尼尔·拉夫特里 2 8 11, 亚当·马戈林 4 5, R大卫·霍金斯 2 9, Randall T Moon公司 2 15 16, 卡罗尔·B·瓦尔 2 6, 汉内尔·鲁霍拉·巴克 1 2
附属机构

代谢组在人类胚胎干细胞从幼体到质体的转化过程中调节表观遗传景观

亨利克·斯珀伯等。 Nat细胞生物学. 2015年12月.

摘要

近一个世纪以来，发育生物学家已经认识到，胚胎细胞分化为不同细胞类型的潜力可能不同。最近，人们认识到，来自小鼠和人类的胚胎干细胞表现出两种稳定但在表观遗传学上截然不同的多能性状态：幼稚和启动。我们现在发现，烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）和代谢状态调节人类胚胎干细胞（hESCs）的多能性。具体而言，在幼稚hESCs中，NNMT及其酶促产物1-甲基烟酰胺高度上调，并且低S-腺苷甲硫氨酸（SAM）水平和H3K27me3抑制状态需要NNMT。NNMT在原始细胞中消耗SAM，使其无法用于抑制Wnt并激活启动的hESC中HIF通路的组蛋白甲基化。这些数据支持代谢组调节人类发展早期阶段的表观遗传景观的假设。

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数字

图1
图1。幼稚和启动的ESC在新陈代谢上不同
A： 本研究（Elf1、H14i–LIF、Lis1、H1）和其他研究中RNA-seq数据的PCA,,–,. ComBat应用于组合RNA-seq数据集。B： 导致分离启动型和幼稚型hESC主要成分的基因。点的大小与PC1值的平方成正比。最重要的基因颜色更深。C： 幼稚（Elf1，H1-4iLIF）和启动（H1）hESCs的代谢谱。根据MitoStress方案显示OCR变化的痕迹（s.e.m，n=6个生物复制）。D： 与原始的hESCs（Elf1和H1-4iLIF）相比，引物hESC（H7和H1）减少了OCR对FCCP的反应变化，n=18（H1，H14iLIF；s.e.m.公司。；对于H14iLIFvs，p=0.122。H1vs的Elf1，p=0.0001。H7vs的Elf1，p=0.0014。Elf1；双尾t检验。E-F：幼稚的hESCs Elf1（E）和WIN1（F）通过在ActivinA-FGF（AF）培养基中培养，在1至3天后向更原始的状态过渡，减少了OCR变化，以应对FCCP（n=29，Elf AF 1D，n=20，Elf AF 2D，n=28，Elf A3，n=33，n=18，WIN1和WIN1 AF；s.E.m。；ElfAF1Dvs的p=0.0013。Elf1，ElfAF2Dvs的p<0.001。Elf1、ElfAF3Dvs。Elf1和WIN1AFvs。WIN1；双尾t检验）。G： 线粒体复合体基因在启动期和幼年期之间的热图对数表达变化。H–I:Naive hESCs（Elf1）和primed hESC（Elf1-AF）具有相似的线粒体DNA拷贝数（H，n=3）和线粒体突变频率（I，n=3）。S.e.m.公司。；p=0.7802（H），p=0.37和0.6（I）；双尾t检验。J： HIF1α蛋白在启动的hESCs（H7和Elf1 AF）中稳定。K： 蛋白质组学工作流程用于识别启动和未启动的人胚胎干细胞中差异调节的蛋白质表达。五十： 启动的hESCs（右，绿色；Elf1 AF）与原始细胞（左，蓝色，Elf1）差异表达蛋白的火山图。显示了显著的命中（FDR<0.05）。在融合轨道仪上通过纳米LC MS/MS对蛋白质进行定量。M： Western blot分析显示，与原始hESCs（Elf1）相比，JARID2和LDHA蛋白在启动的hESCs中上调。补充资料图9显示了未经处理的吸墨纸原始扫描。原始数据见补充表4。n=生物复制次数。
图2
图2。幼稚和启动ESC的代谢组学分析
A： 小鼠和人类幼稚（植入前）和引物（植入后）ESCs代谢产物的质谱实验方案。B-C：根据其代谢特征，可以清楚地分离出原始干细胞和启动干细胞。（B） 水溶性非目标GC-MS代谢组学数据的PCA图。第一个主成分（PC）将启动细胞类型（左）与原始细胞类型（右）分开，解释了50.5%的总方差。（C） 非目标LC代谢组学数据的PCA图。沿着第一个PC有3个簇：启动细胞（左），启动细胞切换回原始细胞（中）和原始细胞（右）。第一个PC解释了68.2%的总方差。D–G：通过GC-TOF和hESCs（F:GC-TOF，G:LC-QQQ-MS）检测到的mESCs（D，E）中启动细胞和幼稚细胞之间差异丰富代谢物的火山图。x轴是丰度的对数2倍变化，y轴是p值的负对数10。标记生物感兴趣的代谢物以供进一步分析。H： 糖酵解途径的可视化以及与脂质和氨基酸合成的联系。一： 糖酵解代谢物的折叠变化（n=3，s.e.m.；葡萄糖（p=0.6630），G1P-G6P-F6P-F1P（p=0.3713），F16BP-F26BP（p=0.0070），D-GA3P-DHAP（p=0.0058），PEP（p=0.1925），丙酮酸（p=0.1416）；双尾t检验），并通过目标LC-QQQ-MS检测到H1与Elf1的平均中心。有关原始数据，请参阅补充表1和4。n=生物复制次数。
图3
图3。启动的ESC积累脂质，而幼稚的ESC使用脂肪酸作为能量来源
A–B：与原始hESC（Elf1）中更丰富的脂质相比，原始hESCs（H1）中更多的脂质具有更多的碳原子（A）和更大的质量（B）。C： 引发的mESCs（R1AF）中更丰富的脂质比幼稚的mESCs（R1）中更丰富的脂质更不饱和。n=6，p值Wilcoxon秩和检验。方框表示中间值，25第个和75第个分位数。晶须在75以上延伸1.5 IQR第个分位数及以下25第个分位数。点表示胡须以外的值。D-E:BODIPY 493/503染色显示，与幼稚人类（Elf1 AF，D）和小鼠（R1，E）ESC相比，在启动的人类（Elf1，D）与小鼠（EpiSCs，E）的ESC中脂质滴积累增加。比例尺，50µm。F： 与我们和其他研究中的幼稚ESC相比，CPT1A在人类和小鼠启动的ESC中下调。n=从左到右（已初始化，天真）：2,1；3,3; 2,5; 3,3; 3,3; 3,9; 3,2. 显示负二项检验p值。G： CPT1A基因的ChIP-seq分析显示，与单纯性hESCs（Elf1；单纯性C1，单纯性BGO1，单纯性WIBR3）相比，引物性hESC（C1，WIBR3，H1，H9）中H3K27me3标记更具抑制性，H3K4me3和H3K29ac标记活性更低。H： 火山图，幼稚hESCs（Elf1）和引物hESCs中的microRNA表达（H1，ENCODE，补充表1M）。一： hsa-miR-9和hsa-miR-10a的qPCR表达（分别预测靶向CPT1A和FASN）。Elf1与H1相比，hsa-miR-10a高34倍，hsa-miR-9低4倍（n=3，s.e.m；miR-10a:p=0.004，miR-9:p=0.022；双尾t检验）。J-L：海马棕榈酸酯试验表明，幼稚的人类和小鼠ESC使用脂肪酸作为能量来源。添加棕榈酸酯或BSA载体后，人类ESC（幼稚Elf1和引物H7，J）和小鼠ESCs（幼稚性R1和引体EpiSCs，K）中的OCR变化很小。Elf1BSA、R1BSA、EpiBSA的n=4，Elf1PALM、R1PALM和EpiPALM的n=5，H7BSA、H7PALM为n=6；皮下注射ETO后的变化以L（Elf1BSA（n=12）、R1BSA（n=12），EpiBSA（n=12）、Elf1PALM（n=15）、R1PALM。；原始人胚胎干细胞：p=0.0096，素性人胚胎干系统：p=0.354，原始人胚胎细胞干细胞：p=0.03，素性mESC：p=0.88，双尾t检验）。原始数据见补充表4。n=生物复制次数。
图4
图4。氨基酸蛋氨酸和色氨酸在幼稚和启动的人胚胎干细胞中受到不同的调节
A： 色氨酸-尿氨酸途径模型。B： 与原始hESC相比，IDO1在启动的hESCs中高度表达（qPCR，H14iLIF n=3，ElfAF n=4，H12iF，H1，H7 n=5，Elf 2iLIF；s.e.m.；***p<0.001；双尾t检验）。C： 靶向（n=6）和非靶向（HILIC:n=4，QQQ n=3）质谱检测到，启动的hESCs中的犬尿氨酸与色氨酸的比率高于初始的hESC。s.e.m*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；单尾t检验）。D： SAM通路和NNMT模型。红色代谢物在启动的hESCs中上调。蓝色的代谢物和酶在幼稚的人胚胎干细胞中上调。E： 原始hESCs（Elf1）和原始hESC（H1）RNA-seq数据的火山图。变化大于2倍且FDR<0.05的基因是有色的。NNMT和IDO1是差异表达最多的基因。F： 与引物hESC（qPCR）相比，NNMT在幼稚hESCs中高度上调。数字表明，与H1和H7启动的hESC相比，原始hESC的折叠变化。（WIN1、H75iLAF、Elf1、H14iLIF、H14iLTF、LIS1、WIN1F、Elf1AF的n=3，WIN15iLA、H12iF、H1、H7的n=4，H75iLIF的n=5；s.e.m.；***p<0.001；双尾t检验）G:Naive hESC（每个n=4）的1-MNA含量高于primed hESCs（H1=4，WIN1TeSR、ElfAF的n=6）（s.e.m.**p<0.000，双尾t检验）。在NNMT的Elf1 CRISPR-Cas9 KO突变体中未检测到1-MNA（gNNMT 7.2.1，n=6；gNNMT 6.2.4，n=5）。H： 原始人胚胎干细胞（H1 n=4，Elf AF n=6）的SAM水平高于原始人胚胎细胞（Elf1 n=5）（s.e.m.；ElfAF对Elf1的p=0.0089，H1对Elf1的p=0.0376；双尾t检验）。I-J:SAM在幼稚的hESCs中诱导“启动子样”代谢谱。在不含蛋氨酸的培养基中添加SAM（500µM）5小时可减少幼稚hESCs（WIN1）对FCCP的OCR变化。Seahorse跟踪显示在I（n=6；s.e.m）中。FCCP后OCR变化以J表示（n=23；s.e.m.；p=0.017）。K： NNMT的过度表达延迟了从幼稚到启动的代谢转变（n=4；s.e.m.；p=0.028，双尾t检验）。有关原始数据和精确p值，请参阅补充表4。n=生物复制次数。
图5
图5。幼稚人胚胎干细胞中高NNMT表达调节组蛋白甲基化状态
A： 为Ware等人、Gafni等人、Theunissen等人、Bernstein等人（左面板）和Chan等人（右面板）的ChIP-seq数据集绘制了648个发育基因转录起始位点（TSS）周围的H3K27me3读取映射5kb。B： Western blot分析显示，启动的hESCs（H7，Elf1 AF）中的H3K27me3和H3K9me3高于初始的hESC（Elf1）。C： qPCR分析显示，使用siRNA（50 nM，72 h）在幼稚人胚胎干细胞（Elf1）中敲除NNMT，导致1-MNA水平下降（qPCR n=3；s.e.m.，p=0.001，双尾t检验；HILIC n=4，s.e.m，p=0.039，单尾t检验）D：Western blot分析用针对NNMT的siRNA或针对荧光素酶的siRNA处理的Elf1细胞组蛋白标记作为对照。E： 与siLUC相比，siNNMT中表达较高（较低）的基因之间重叠的超几何检验p值，以及与多个研究中的原始系相比，引物系中表达较高的基因之间的重叠超几何检验p值。色度与p值的负log10成比例。siLUC转录组特征与ELFAF和Elf1数据集有显著重叠。F： 用100µM STAT3抑制剂处理Elf1细胞后组蛋白修饰的Western blot分析。G： 对所有基因的ChipSeq分析显示，在Elf1细胞中用STAT3抑制剂（100µM）处理6h会增加H3K27me3标记。H： WNT配体和EGLN1是313个重叠基因中的一个，在引物性和幼稚性hESCs中H3K27me3标记增加(8,10,64)与Elf1细胞相比，用100uM STAT3抑制剂处理Elf1电池6小时。一： H3K27me3的窗口染色质热图显示313个重叠基因的启动子+/-5kb，H3K17me3增加。J： 根据ChIP-seq数据绘制出TSS周围5kb的H3K27me3读数，用于绘制原始hESC（C1、WIBR3、BGO1和Elf1）、原始hESCs（C1、WIBR3、H1）和用100µM STAT3抑制剂处理6h的原始hESCsElf1。补充图9显示了未经处理的斑点原始扫描。原始数据见补充表4。n=生物重复次数。
图6
图6。WNT途径在幼稚hESCs中激活
A： WNT配体和WNT靶点在启动的hESCs（H1，Elf1 AF）和原始hESCs中的基因表达热图。B： Wnt在幼稚的hESCs中被激活。原始（Elf1）和引物（Elf1-AF）BAR报告细胞中的内源性Wnt信号。比例尺代表200µm。C： 72小时后，Wnt抑制剂IWP2（2µM）和Wnt拮抗剂XAV939（5µM。D： IWP2（2µM，48h）对Wnt的抑制降低了初级hESCs（Elf1，WIN1）和初级hESC向启动子（WIN1 AF）转化后FCCP的OCR变化。OCR变化的轨迹显示在Elf1中（Elf1的n=8，Elf1+IWP2的n=6；s.e.m.）。对FCCP后的OCR变化进行了量化（Elf1 n=8，Elf1+IWP2 n=6，WIN1，WIN1+IWP，WIN1AF n=7，WIN1AF+IWP1；s.e.m.，Elf1+IWP2 vs.Elf1 p=0.0009，WIN1+IWP vs.WIN1 p=0.0084，WIN1AF+IWP2vs.WIN1AF.p=0.0006，双尾t检验）。E： qPCR分析显示，IWP2（2µM，72h）对Wnt的抑制下调了原始人胚胎干细胞（Elf1）中NNMT和miR-372的表达。（n=3；s.e.m.；miR-372的p=0.04，NNMT的p=6.44E-06；单尾t检验）。F： 启动的人胚胎干细胞WNT和NNMT之间的自我增强环模型。原始数据见补充表4。n=生物复制次数。
图7
图7。HIF1α是幼稚到启动hESC过渡所必需的
A： 初生hESCs[Elf1、WIRB3初生和BGO1初生]、引物hESCs[WIRB3引物、H1和H9以及用STAT3抑制剂（100µM）处理6小时的Elf1中EGLN1（PHD2）的RNA表达和H3K27me3标记的屏幕截图导致VHL介导的蛋白水解。C-D：对HIF1αCRISPR-Cas9敲除（KO）突变克隆（gHIF1 6.2.1，C；gHIF1 6.3.1，D）的跟踪文件、DNA序列和蛋白质序列进行测序。E： 野生型HIF1α蛋白和由CRISPR-Cas9敲除（KO）突变体gHIF1 6.2.1和gHIF1 6.3.1产生的蛋白的示意图。bHLH=基本螺旋-环-螺旋结构域，PAS=Per-Arnt-Sim结构域，NTAD=N末端转录激活结构域，CTAD=C末端转录激活域。F： HIF1α在CRISPR-Cas9-KO突变体中不表达。通过在野生型Elf1细胞（iCas9 Elf1）和HIF1α的两个CRISPR-Cas9 KO突变体（gHIF1 6.2.1和gHIF1 6.3.1）的TeSR1中培养5天，对HIF1α在细胞中的表达进行Western blot分析。G： hESCs向引物转化的qPCR分析表明，与野生型Elf1相比，在Elf1 HIF1αCRISPR-Cas9 KO细胞中，原始标记（DNMT3L和NNMT）的表达仍然较高，而引物标记IDO1和HIF靶基因（PDK1和VEGFA）的表达下调（n=3；s.e.m。；DNMT3L的p=0.024，NNMT的p=0.0005，IDO1的p=0.001，PDK1的p=0.12，VEGFA的p=0.004；双尾t检验）。H： 如使用SeaHorse测量FCCP添加后的OCR所示，HIF1α的KO可防止hESCs从幼稚状态过渡到启动状态期间发生代谢转换。对于gHIF1 6.3.1 2iLIF和AF，n=3；对于Elf iCas9和gHIF1 6.2.1 2 iLIF及AF，n=4；s.e.m。；gHIF1 6.2.1 vs.Elf iCas9的p=0.0117，gHIF1 6.3.1 vs.Elf iCas8的p=0.0032；双尾t检验。补充图9显示了未经处理的斑点原始扫描。原始数据见补充表4。n=生物复制次数。
图8
图8。NNMT通过抑制Wnt通路和激活HIF通路影响从幼稚到启动的hESC转变
A–B：根据各种NNMT CRISPR-Cas9 KO突变克隆（gNNMT 7.2.1，A；gNNMT 6.2.4，B）的序列（Pymol）预测的测序跟踪文件、DNA序列、蛋白质序列和3D蛋白质结构。绿色代表CRISPR-Cas9突变中截短的NNMT蛋白。C： 野生型NNMT蛋白质和CRISPR-Cas9 KO突变体gNNMT 7.2.1和gNNMT 6.2.4产生的蛋白质的示意图。D： Elf1 NNMT CRISPR-Cas9 KO细胞的SAM含量高于野生型Elf1细胞（n=6；s.e.m.；gNNMT7.2.1的p=1.23E-05，gNNMT6.2.4的p=5.47E-06；双尾t检验）。E： Western blot分析显示，与对照Elf1（iCas9）细胞相比，Elf1 CRISPR-Cas9 KO突变体gNNMT 7.2.1和gNNMT 6.2.4中HIF1α的表达和H3K27me3标记更高。F： 野生型Elf1细胞（n=6）和Elf1 CRISPR-Cas9 KO突变体gNNMT 7.2.1（n=5）和gNNMT 6.2.4（n=3）中原始标记DNMT3L的qPCR分析。s.e.m.公司。；gNNMT 6.2.4 vs.Elf1的p=0.0009，gNNMT 7.2.1 vs.Elf1的p=0.027；双尾t检验。G： 与野生型Elf1细胞（RNAseq）相比，Elf1 CRISPR-Cas9 KO gNNMT 7.2.1中NNMT、WNT配体和HIF靶基因的对数倍表达变化。H： 本研究对CRISPR NNMT基因敲除株系和不同初生株系和引物株系进行了PCA分析。gNNMT 6.2.2和gNNM 7.3.5为异生性对照。PC1（x轴）解释了数据中的大多数变化（61%），gNNMT 7.2.1敲除线沿x轴亚空间移动，远离其他初始线，并朝着初始状态移动。一： 与Elf1相比，gNNMT 7.2.1中表达较高（较低）的基因之间重叠的超几何检验p值，与多项研究中的原始系相比，引物系中表达较高的基因之间的重叠超几何检验p值。色度与p值的负log10成正比。gNNMT 7.2.1转录组特征与所有已发表的引物转录组数据集有显著重叠，支持其向引物阶段过渡。J： 人类胚胎干细胞代谢和表观遗传之间复杂关系的模型。补充图9显示了未经处理的斑点原始扫描。原始数据见补充表4。n=生物复制次数。
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中的注释

  • 代谢退出幼稚多能性。
    Wu J，Izpisua Belmonte JC。 吴杰等。 自然细胞生物学。2015年12月；17(12):1519-21. doi:10.1038/ncb36269。 自然细胞生物学。2015 采购管理信息：26612574

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