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.2015年11月5日；10（11）：e0142280。
doi:10.1371/journal.pone.0142280。 2015年电子收集。

硫氧还蛋白-2在基础和靶向剥夺条件下调节胚胎鸡脊髓神经元程序性细胞死亡

马克·皮尔森 1, 斯特凡妮·德布鲁尔 1, 安德烈·克利佩 1, 弗雷德里克·克洛特曼 2, 伯纳德·诺普斯 1
附属公司

硫氧还蛋白-2在基础和靶点剥夺条件下调节胚胎鸡脊髓神经元程序性细胞死亡

马克·皮尔森等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

硫氧还蛋白-2（Trx2）是一种线粒体蛋白质，使用二硫醇活性位点来还原蛋白质二硫化物。除了这种酶的细胞保护功能外，一些研究还强调了Trx2在细胞信号事件中的意义。尤其是，越来越多的证据表明，氧化还原酶在中枢神经系统的发育过程中发挥着这种作用。在这里，我们研究了Trx2在鸡脊髓胚胎发育中的潜在意义。为此，我们首先研究了该酶在该组织中的分布，并报告了Trx2在E4.5鸡胚有丝分裂后神经元和E6.5运动神经元中的强表达。通过卵泡电穿孔，我们进一步强调了Trx2在脊髓发育过程中以及在一种新的培养脊髓外植体模型中对神经元程序性细胞死亡（PCD）的细胞保护作用。这些发现表明，Trx2可能通过氧化还原调节机制，在脊髓胚胎发育期间调节神经元的PCD发育。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。鸡脊髓Trx2抗体验证。
（A-D）用抗Trx2（A，B）抗体和重组Trx2预吸附抗体对E4.5和E6.5鸡胚脊髓进行免疫荧光检测。用线粒体标记物ATPB（E-H）对抗Trx2进行克隆化。比例尺=50μm（A-D）和10μm（E-H）。
图2
图2。五倍子Trx2 cDNA和氨基酸序列。
（A） 的顺序五倍子从鸡心、肝、肺和肌肉总cDNA中扩增Trx2 PCR，并预测氨基酸序列。扩增得到642-bp的扩增子，而不是NCBI参考序列中预期的482-bp扩增子（登录号：NM_001031410.1）。这种差异与位于整体3'-一半的160-bp序列（用黄色表示）有关五倍子Trx2 cDNA。（B） 对齐五倍子根据cDNA序列预测Trx2蛋白，包含人类（登录号：Q99757）和小鼠（登录号为P97493）Trx2氨基酸序列。用于设计正向和反向扩增引物的核苷酸序列用黑色箭头表示。线粒体靶向序列（MTS）以绿色表示，保守催化WCGPC动机以红色表示。
图3
图3。Trx2与E4.5处的NeuN阳性细胞和E6.5处的Isl1/2阳性细胞共定位。
胚胎鸡脊髓中Trx2与NeuN在E4.5（A-C）和Isl1/2在E6.5（D-F）的克隆化。比例尺=50μm。
图4
图4。Trx2的过度表达和下调在ovo中电穿孔。
（A-H）用Trx2载体或MoTrx2电穿孔的E4.5鸡胚脊髓中Trx2的免疫荧光检测。（一） 用空载体、Trx2载体、MoCTRL或MoTrx2对E4.5鸡胚解剖脊髓的对侧（非电穿孔；左孔）和同侧（电穿孔；右孔）进行Western blotting分析。（J） Trx2表达的密度分析，显示为同侧测量值与对侧测量值的比值。比例尺=50μm。
图5
图5。Trx2的过度表达或下调不会影响E4.5鸡胚脊髓神经元群的标记物。
用Trx2载体（A-H）和MoTrx2（I-P）电穿孔的E4.5鸡胚用几种神经元亚群标记物（NeuN、Isl1/2、Lhx3、Lhx1/5、Nkx2.2、Evx1）和细胞凋亡标记物（裂解的Casp-3）进行探测。比例尺=50μm。
图6
图6。Trx2过度表达和下调影响E6.5鸡脊髓神经元PCD。
用Trx2载体或MoTrx2电穿孔的E6.5鸡胚脊髓中运动神经元标记物Isl1/2和凋亡标记物裂解Casp-3的（A-F）免疫荧光检测和（G-J）TUNEL染色。（K） 用空载体（N=4）、Trx2载体（N=9）、MoCTRL（N=4）或MoTrx2（N=5）电穿孔的E6.5鸡胚脊髓切片同侧和对侧的平均TUNEL阳性细胞计数的比较。统计显著性如下：ns=无显著性，*=p<0.05，***=p<0.0005。
图7
图7。Trx2下调增加靶向性脊髓外植体中的神经元PCD。
（A-F）培养12h后，用Trx2载体和MoTrx2电穿孔的E4.5鸡脊髓中运动神经元标志物Isl1/2和凋亡标志物裂解的Casp-3的免疫荧光检测和（G-J）TUNEL染色，（K）用空载体（N=6）、Trx2载体（N=6）、MoCTRL（N=5）或MoTrx2（N=5）电穿孔的E4.5鸡脊髓移植物同侧和对侧的平均TUNEL阳性细胞计数的比较。统计显著性如下：ns=无显著性，*=p<0.05。
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