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.2016年1月；17(1):95-103.
doi:10.1038/ni.3313。 Epub 2015年11月2日。

癌症通过糖酵解限制靶向microRNA和EZH2介导效应性T细胞功能障碍

Ende Zhao（赵恩德） 1 2, Tomasz少校 1, 伊洛娜·克里切克 1, 魏丽 1 2, 柯武 1 2, 赵丽丽（Lili Zhao） 三, 双伟 1, 乔尔·克雷斯波 1, 鄯善湾 1, 琳达·瓦坦 1, Wojciech Szeliga公司 1, 艾琳·邵 1, 王殷（音） 1, 刘燕（Yan Liu） 1, Sooryanarayana Varambally公司 4 5, 阿鲁尔M钦奈扬 5, 西奥多·H·威林 1, 维克托·马尔克斯 6, 扬·科塔斯基 7, 王洪波 2 8, 王泽华 8, 张毅（音） 9, 丽贝卡·刘 10, 王国斌 2, 邹卫平 1 11 12
附属公司

癌症通过糖酵解限制靶向microRNA和EZH2介导效应性T细胞功能障碍

Ende Zhao（赵恩德）等。 自然免疫. 2016年1月.

摘要

有氧糖酵解调节T细胞功能。然而，原发性癌症是否以及如何改变T细胞糖酵解代谢并影响癌症患者的肿瘤免疫仍是一个问题。在这里，我们发现卵巢癌通过维持微小RNA miR-101和miR-26a的高表达，对T细胞施加葡萄糖限制，并抑制其功能，这限制了甲基转移酶EZH2的表达。EZH2通过Lys27处组蛋白H3的三甲基化抑制Notch阻遏物Numb和Fbxw7，从而激活Notch通路，从而刺激T细胞多功能细胞因子的表达，并通过Bcl-2信号促进其生存。此外，小发夹RNA介导的T细胞中人EZH2的敲除引起了较差的抗肿瘤免疫。EZH2（+）CD8（+）T细胞与患者生存率的提高相关。总之，这些数据揭示了癌症免疫逃避的代谢目标和机制。

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数字

图1
图1。EZH2型+T细胞具有多功能和抗凋亡的特性
(a、 b条)EZH2的表型+T细胞。用EZH2、CD45RA、CD62L、CD45RO、KLRG1、Tim-3、CD57和T细胞标记物抗体对健康献血者外周血单个核细胞进行染色，并用LSR II进行分析。图中显示了8名捐赠者的一名代表。(c、 d日)血液中的EZH2和多功能T细胞。对外周血单个核细胞进行细胞内IFN-γ、TNF和颗粒酶B染色。分析CD4中EZH2的表达+T细胞表达IL-2、IFN-γ、TNF或CD8的单一、双重、三重或无标记+T细胞表达IFN-γ、TNF和颗粒酶B的单标记、双标记、三标记或无标记。结果显示为6个流式细胞仪点图之一(c（c）)和平均百分比±SEM(d日). Wilcoxon秩和检验，*P<0.05。(e（电子）)EZH2型+卵巢癌中的T细胞。从卵巢癌组织中提取单个细胞，并对其进行T细胞标记物、KLRG1、Tim-3、CD57和EZH2染色。CD8（CD8）+流式细胞术分析T细胞。象限中的数字是CD45中细胞的百分比+CD3（CD3）+CD8（CD8）+大门。图中显示了一位20人的代表性捐赠者。(如果)卵巢癌中的EZH2和多功能T细胞。对卵巢癌组织制成的单个细胞进行细胞内染色，以检测T细胞标记物、IFN-γ、TNF、颗粒酶B和EZH2。IFN-γ、TNF和颗粒酶B三重阳性（多功能）CD8+根据EZH2的表达分析T细胞。N=5，Wilcoxon秩和检验，*P<0.01。(克)卵巢癌中EZH2表达与T细胞凋亡的关系。冷冻卵巢癌组织用抗CD3（绿色）、抗EZH2（白色）、TUNEL（红色）和DAPI（蓝色）染色。隧道+CD3（CD3）+EZH2型+T细胞（白色）用白色箭头标记。TUNEL百分比+CD3（CD3）+在EZH2中测定T细胞（平均值±SEM）+和EZH2−T细胞。N=10，Wilcoxon秩和检验，*P<0.05。(小时)Bcl-2在多功能T细胞中的表达。CD8（CD8）+用抗CD3和抗CD28刺激T细胞2天。用流式细胞术分析IFN-γ、TNF、颗粒酶B和Bcl-2的表达。结果显示为多功能（三阳性）CD8中Bcl-2表达的平均荧光强度（MFI）（平均值±SD）+T细胞。N=6，Wilcoxon秩和检验，*P<0.05。(我)Bcl-2在EZH2中的表达+CD8（CD8）+T细胞。CD8（CD8）+用抗CD3和抗CD28刺激T细胞2天。流式细胞术分析EZH2和Bcl-2的表达。结果显示为EZH2中Bcl-2表达的MFI（平均值±SD）+CD8（CD8）+T细胞。N=6，Wilcoxon秩和检验，*P<0.05。(j个)顺铂对多功能T细胞的影响。CD8（CD8）+用抗CD3和抗CD28刺激T细胞5天。第4天在培养基中加入顺铂。对细胞进行多功能表型染色（IFN-γ、TNF和颗粒酶B）。总T细胞数、三阳性CD8的百分比和绝对数+显示T细胞。N=4，Wilcoxon秩和检验，*P<0.05。(k–m（千米）)卵巢癌浸润T细胞和外周血T细胞中EZH2/KLRG1（k）、EZH2/Tim-3（l）和EZH2/CD57（m）的比率。表达CD8的KLRG1、Tim-3和EZH2水平+流式细胞术分析T细胞。结果显示为平均值±SEM。N=30，Mann-Whitney U检验，*P<0.05。(n–p)卵巢癌浸润T细胞和正常卵巢囊肿T细胞中EZH2/KLRG1（n）、EZH2/Tim-3（o）和EZH2/CD57（p）的比值。CD8（CD8）+流式细胞仪分析T细胞，数据显示为平均值±SEM。卵巢囊肿组织：N=11，癌症样本：N=7，Mann-Whitney U检验，*P<0.05。
图2
图2。EZH2调节效应T细胞多功能性和存活
(一)DZNep对T细胞EZH2和H3K27me3表达的影响。在没有或存在5μM DZNep的情况下，用抗CD3和抗CD28抗体刺激T细胞3天。用免疫印迹法检测EZH2、H3K27me3、H3和β-肌动蛋白的表达。给出了一个4的代表性实验。(b、 c)DZNep对CD8多官能团的影响+T细胞。CD8（CD8）+在没有或存在5μM DZNep的情况下，用抗CD3和抗CD28抗体激活T细胞3天。用流式细胞术分析IFN-γ、TNF和颗粒酶B的表达。双倍的百分比(b条)和三重阳性(c（c）)显示单元格。数据以平均值±SEM表示，N=5，Wilcoxon秩和检验，*P<0.05。(d–f)shEZH2对CD8中EZH2和H3K27me3表达及多功能性的影响+T细胞。用shEZH2或打乱载体转染的T细胞被激活3天。用免疫印迹法检测EZH2和H3K27me3的表达(d日). 用流式细胞术分析IFN-γ、TNF和颗粒酶B的表达。双倍的百分比(e（电子）)和三重阳性(如果)显示单元格。3名捐赠者有重复。学生t检验，*P<0.05。(g–i类)GSK126对CD8中H3K27me3表达和多功能性的影响+T细胞。用抗CD3和抗CD28抗体刺激T细胞4天。在第0天和第2天添加10μM GSK126。用免疫印迹法检测3例重复供体中EZH2、H3K27me3、H3和β-actin的表达(克). 用流式细胞术分析IFN-γ、TNF和颗粒酶B的表达。双倍的百分比(小时)和三重阳性(我)细胞显示（平均值±SEM，N=5，Wilcoxon秩和，*P<0.05）。(j个)EZH2对T细胞凋亡的影响。用5μM DZNep、10μM GSK126或shEZH2转染T细胞，并用抗CD3和抗CD28抗体激活2天。用Annexin V和7-AAD染色评价T细胞凋亡。测试了5个捐赠者中的一个的代表性点图。(k、 我)EZH2阻断对Bcl-2表达的影响。用5μM DZNep或shEZH2转染T细胞并激活3天。免疫印迹法检测Bcl-2、EZH2和β-肌动蛋白的表达。显示了5个实验中的一个。(米)EZH2阻断对Bcl-2启动子活性的影响。293T细胞与编码shEZH2或scramb的载体和hBCL-2-EGFP载体共转染2天。启动子活性通过流式细胞仪进行分析，并表示为GFP表达的百分比（平均值±SD）。N=4，*P<0.05。
图3
图3。EZH2抑制Notch阻遏物、T细胞多功能性和生存
(一)T细胞中EZH2和Notch的动力学激活。在指定的时间内用抗CD3和抗CD28抗体刺激T细胞。免疫印迹法检测NICD、EZH2和β-肌动蛋白的表达。显示了3的一个代表性实验。(b条)EZH2阻断对Notch激活的影响。ShEZH2慢病毒转染的T细胞被激活3天。免疫印迹法检测NICD、EZH2和β-actin的表达。显示了3个实验中的一个代表性实验。(c、 d日)DZNep对Notch信号基因表达的影响。在5μM DZNep存在下激活人T细胞2天。活性Notch信号基因的表达(HES1型,嘿1、和HEY2公司) (c（c）)，和Notch抑制基因(麻木的和FBXW7型) (d日)通过实时PCR定量。结果表示为相对表达式（平均值±SD）。N=5，Wilcoxon检验，*P<0.05。(e（电子）)H3K27me3与麻木的和FBXW7型用shEZH2或scramb转染Jurkat细胞。用抗H3K27me3抗体进行ChIP检测。H3K27me3在小鼠近端启动子区的占有率麻木的和FBXW7型检查并表示为输入百分比（平均值±SEM）。N=4次转染，每次三次，Wilcoxon试验，*P<0.05。(f–h)Notch信号抑制对T细胞多功能性和凋亡的影响。CD8（CD8）+在两种γ分泌酶抑制剂（DAPT和GSI-I）存在下，用抗CD3和抗CD28激活T细胞。多功能性(f、 克)和细胞凋亡(小时)流式细胞仪分析。显示了3位捐赠者的数据（平均值±扫描电镜）。Mann-Whitney U检验，*P<0.05。
图4
图4。肿瘤通过葡萄糖限制损害T细胞多功能性和生存
(一)不同培养基中葡萄糖的浓度。在正常培养基、原发性卵巢癌细胞培养基以及补充有额外葡萄糖的这两种培养基中检测到葡萄糖。与肿瘤细胞培养后，向肿瘤培养基补充额外的2 mg/ml葡萄糖。结果显示为平均值±SEM，N=4，Wilcoxon秩和检验，*P<0.05。(b、 c)正常和肿瘤条件记忆CD8的代谢谱+T细胞。存储器CD8+T细胞在添加或不添加葡萄糖的培养基或肿瘤条件培养上清中预先培养过夜，并用抗CD3和抗CD28激活。ECAR公司(b条)和ECAR/OCR比率(c（c）)在Seahorse XF24分析仪的不同时间点进行分析。结果显示为每个处理的四个重复的平均值±SEM。来自4个不同供体的4个独立实验之一的代表性数据。(d–f)肿瘤相关葡萄糖限制对CD8的影响+T细胞多功能性与凋亡。存储器CD8+T细胞在添加或不添加葡萄糖的培养基或肿瘤条件培养上清液中预先培养过夜，并用抗CD3和抗CD28抗体清洗和刺激48小时。通过流式细胞术分析多功能图谱。结果显示为双阳性(d日)和三重阳性(e（电子）)IFN-γ、TNF和颗粒酶B细胞凋亡的细胞(如果)通过Annexin V染色测定，并通过流式细胞仪进行分析。结果显示4名捐赠者的平均值±SEM。Mann-Whitney U检验，*P<0.05。(g、 小时)2-DG对CD8的影响+T细胞多功能性与凋亡。CD8（CD8）+在存在或不存在2-DG的情况下，用抗CD3和抗CD28激活T细胞3天。多功能性(克)和Annexin V结合(小时)流式细胞仪检测。结果显示为4名捐赠者的平均值±SD。Wilcoxon秩和检验，*P<0.05。
图5
图5。肿瘤通过microRNA101和microRNA26通过葡萄糖限制控制T细胞EZH2
(a、 b条)肿瘤相关葡萄糖限制对T细胞EZH2表达的影响。CD4细胞+(一)和CD8+(b条)在添加或不添加葡萄糖的培养基或肿瘤条件培养基中，用抗CD3和抗CD28激活T细胞3天。流式细胞术检测EZH2蛋白表达。结果显示为3名供体EZH2±SEM的平均荧光强度（MFI），Mann-Whitney U检验，*P<0.05(c（c）)2-DG对T细胞EZH2表达的影响。在存在或不存在2-DG的情况下，用抗CD3和抗CD28激活T细胞3天。流式细胞术检测存活T细胞中EZH2蛋白的表达。结果显示，3名供体与对照组的EZH2相对表达±SEM，Mann-Whitney U检验，*P<0.05。(d、 e（电子）)活化CD8中microRNA101和microRNA26a的动态变化+T细胞。CD8（CD8）+在存在或不存在2-DG的情况下，用抗CD3和抗CD28激活T细胞。MicroRNA101基因(d日)和microRNA26a(e（电子）)在不同时间点用qPCR检测。结果显示为相对microRNA表达。图中显示了2名捐赠者中的一名。(f、 克)肿瘤相关葡萄糖限制对CD8细胞微小RNA表达的影响+T细胞。存储器CD8+T细胞在添加或不添加葡萄糖的培养基或肿瘤条件培养上清液中预先培养过夜，然后清洗并用抗CD3和抗CD28抗体刺激12小时。microRNA101的丰度(如果)和microRNA26a(克)用qPCR检测。数据表示为平均值±SEM，N=3，Mann-Whitney U检验，*P<0.05。(h–j小时)microRNA模拟物对T细胞EZH2表达、多功能特征和凋亡的影响。存储器CD8+用microRNA101模拟物、micorRNA26a模拟物或对照寡核苷酸对T细胞进行核感染，并用抗CD3和抗CD28激活48小时。T细胞EZH2表达(小时)，多功能(我)和凋亡(j个)流式细胞术检测。结果显示为EZH2表达的相对平均值(小时)，三重阳性T细胞的平均百分比(我)和Annexin V的平均值+单元格(j个)±SEM，N=4，Mann-Whitney U检验，*P<0.05。
图6
图6。EZH2影响T细胞介导的抗肿瘤免疫和患者生存
(一)生物化学阻断T细胞EZH2对小鼠黑色素瘤转移的影响。将黑色素瘤细胞静脉注射到C57BL/6小鼠体内，诱导肺转移。肿瘤特异性T细胞在有或无1μM DZNep的情况下激活2天，在IL-2中扩增3天。将这些T细胞静脉输注到荷瘤小鼠体内。在第16天计算肺转移位点。N=15只小鼠，每组5只，显示所有个体。(b条)基因阻断T细胞EZH2对小鼠黑色素瘤转移的影响。用表达shEZH2或scramb的慢病毒载体转染的肿瘤特异性T细胞被激活2天，并在IL-2中扩增3天。将这些T细胞静脉输注到荷瘤小鼠体内。在第16天计算肺转移位点。N=每组5-7只，每个点代表单个鼠标。Mann-Whitney U检验，*P<0.05（shEZH2与加扰相比）。(c（c）)阻断T细胞EZH2对人卵巢癌生长的影响。女性NOD/Shi-scid/IL-2Rγ皮下注射人原发性卵巢癌细胞无效的（NSG）小鼠。最初用或不用1μM DZNep处理肿瘤特异性T细胞在体外并经静脉转移到卵巢癌荷瘤NSG小鼠体内。测量肿瘤体积。结果表示为肿瘤体积（平均值±SEM）。N=每组5只小鼠，Mann-Whitney U检验，*P<0.05。(d–i日)肿瘤浸润性T细胞与患者预后。卵巢癌组织芯片用抗CD8和抗EZH2抗体进行免疫组织化学染色。CD8（CD8）+和EZH2+CD8（CD8）+对T细胞进行定量。根据CD8的中值对总生存率和无进展时间间隔进行Kaplan-Meier估计+T细胞数量(d、 e（电子）)、EZH2+CD8（CD8）+T细胞数量(f、 克)和EZH2的百分比+CD8（CD8）+T细胞(h、 我). Kaplan-Meier估计值见补充表1-3。(j、 k个)CD8的相对影响+T细胞数，EZH2+CD8（CD8）+T细胞数量和EZH2的百分比+CD8（CD8）+T细胞对患者长期生存的影响。应用时间依赖性受试者操作特征（ROC）曲线分析评估每个标记物对10年总生存率（OS）的预测准确性(j个)和无病生存（DFS）(k个). AUC，ROC曲线下的面积。
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