Zebrafish lacking functional DNA polymerase gamma survive to juvenile stage, despite rapid and sustained mitochondrial DNA depletion, altered energetics and growth

doi:10.1093/nar/gkv1139

.2015年12月2日；43(21):10338-52.

doi:10.1093/nar/gkv1139。 Epub 2015年10月30日。

斑马鱼缺乏功能性DNA聚合酶γ，尽管线粒体DNA快速持续耗竭，能量和生长发生改变，但仍能存活到幼年期

詹妮弗·杰·拉恩¹, 珍妮弗·贝斯特曼¹, 克里斯塔·D·斯塔克利¹, 雪琳·S·L·陈²

附属公司

¹美国南卡罗来纳州查尔斯顿医科大学药物发现与生物医学系，邮编：29425。
²美国南卡罗来纳州查尔斯顿医科大学药物发现和生物医学科学系，邮编：29425chans@musc.edu。

PMID： 26519465
预防性维修识别码：项目经理4666367
内政部： 10.1093/nar/gkv1139

斑马鱼缺乏功能性DNA聚合酶γ，尽管线粒体DNA快速持续耗竭，能量和生长发生改变，但仍能存活到幼年期

詹妮弗·拉恩等。核酸研究. 2015.

.2015年12月2日；43（21）：10338-52。

doi:10.1093/nar/gkv1139。 Epub 2015年10月30日。

作者

詹妮弗·杰·拉恩¹, 珍妮弗·贝斯特曼¹, 克里斯塔·D·斯塔克利¹, 雪琳·S·L·陈²

附属公司

¹美国南卡罗来纳州查尔斯顿医科大学药物发现与生物医学系，邮编：29425。
²美国南卡罗来纳州查尔斯顿医科大学药物发现和生物医学科学系，邮编：29425chans@musc.edu。

PMID： 26519465
预防性维修识别码：项目经理4666367
内政部： 10.1093/nar/gkv1139

摘要

DNA聚合酶γ（POLG）对线粒体DNA（mtDNA）的复制和修复至关重要。POLG的突变会导致线粒体DNA不稳定和各种人类疾病。在这里，我们通过修改斑马鱼关键且高度保守的聚合酶域中的Polg，创建了一个独特的Polg动物模型。polg（+/-）后代在多种表型和生化指标上与WT兄弟姐妹没有区别。然而，polg（-/-）突变体在受精后一周（wpf）出现了严重的线粒体DNA缺失，发育缓慢，有再生缺陷，但令人惊讶的是，其存活率高达4wpf。利用溴化乙锭（EtBr）进行体内mtDNA聚合酶活性测定以耗尽mtDNA，结果表明，polg（+/-）和WT斑马鱼在去除EtBr2周后完全恢复mtDNA含量。EtBr进一步降低了polg（-/-）动物体内已经很低的mtDNA水平，但在EtBrs释放后mtDNA含量没有恢复。尽管呼吸显著降低，与mtDNA的组织特异性水平相对应，但polg（-/-）动物的ATP含量为WT，乳酸没有增加。这种斑马鱼线粒体疾病模型现在为从多个角度研究线粒体DNA不稳定性提供了独特的机会，因为polg（-/-）突变体可以存活到幼年期，而不是像polg突变体小鼠那样失去胚胎发生的活力。

©作者2015。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。

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数字

**图1。**
TALEN诱导的突变*达尼奥·雷里奥·波尔格*. (A类)TALEN区序列比对。显示TALEN结合位点（方框）。发现了三种不同的突变。Alleles被命名*多路复用器119*,*多路复用器120*,*穆兹121*. (B类)人类蛋白质比对*达尼奥*以及三个已鉴定的Polg聚合酶域突变等位基因。两个突变等位基因(*穆兹119*和*亩120*)产生具有类似错误编码和提前终止的蛋白质。这个*穆兹121*等位基因导致跨越hY955的四个氨基酸缺失（装箱）。

**图2。**
*波尔格^−/−*斑马鱼的存活率降低了3wpf。显示了斑马鱼各年龄段的每个基因型比例。Pearson的齐方值显示在每个条形图上方，表明观察到的比率是否与预期比率存在显著差异。N个=3 dpf时为196，1 wpf时为486，1.5–2 wpf为433，2.5–3 wpf则为875。

**图3。**
*波尔格^−/−*斑马鱼表现出严重且持续的mtDNA缺失，其全长Polg和Vdac1蛋白较少，而杂合子斑马鱼的水平与WT相似(A类)在不同的时间点从整个个体中分离出DNA。平均dCt值计算为*第1个*（线粒体编码基因）减去Ctef1a型（核基因）并用SEM绘制（dCt值、每个时间点的样本大小和*P（P）*-值）。*表示*P（P）*Mann-Whitney非参数检验与WT的差异≤0.05。(B类)3 wpf斑马鱼幼虫Polg和Vdac1线粒体蛋白的代表性western blot分析。在同一凝胶上运行重组人POLG，作为mtDNA聚合酶的阳性对照。(C类)多重印迹的密度测定。n个=3–4。

**图4。**
生长、发育和尾鳍再生在*波尔格^−/−*但不是*波尔格^+/−*斑马鱼。身体长度的平均值±SEM(A类)，车身宽度(B类)和眼睛直径(C类)每种基因型在1-3 wpf下测量。(D类)每个基因型在3 wpf时脊索弯曲角度的累积概率，平均值±SEM在插图中给出。(E类)平均每个年龄组截肢3天后尾鳍再生的±SEM。(F类)每只斑马鱼的3 wpf基因型图像。比例尺=1 mm(**G公司**)3 wpf斑马鱼截肢后即刻（左栏）和3天（右栏）的尾鳍图像。再生量被着色。比例尺=100μm.*表示与WT有显著差异；*P（P）*方差分析/钢结构事后测试≤0.05。有关数值、样本大小和*P（P）*-值。

**图5。**
ATP和乳酸在*波尔格^−/−*斑马鱼。(A类)斑马鱼在1 wpf和3 wpf下的平均全身ATP含量归一化为蛋白质浓度，并用SEM绘制。(B类)用扫描电镜（SEM）绘制了斑马鱼在1 wpf和3 wpf时全身乳酸归一化为蛋白质浓度的曲线。平均值显示在各个条形图上。*表示与WT有显著差异；*P（P）*≤0.05乘以t吨-测试。

**图6。**
*波兰^+/+*和*波尔格^+/−*斑马鱼从EtBr诱导的线粒体DNA缺失中恢复，而*波尔格^−/−*斑马鱼的线粒体DNA仍然缺乏。斑马鱼胚胎在去除EtBr之前，从3 hpf开始用EtBr6天。SEM显示了1、2和3 wpf下的平均dCt值（关于折叠变化值、样品尺寸和*P（P）*-值）。(一)表明未经处理的WT和经EtBr处理过的WT之间存在显著差异；(b条)表明未处理的WT和未处理的之间存在显著差异*波尔格^+/−*; (**c（c）**)表明未处理的WT和未处理的之间存在显著差异*波尔格^−/−*; (d日)表明未经治疗的患者之间存在显著差异*波尔格^−/−*和EtBr-处理*波尔格^−/−*; (**e（电子）**)表明未经治疗的患者之间存在显著差异*波尔格^+/−*和EtBr-处理*波尔格^+/−*动物。在以下情况下实现的重要性*P（P）*曼惠特尼试验≤0.05。

**图7。**
不同组织中的MtDNA含量不同*波尔格^−/−*斑马鱼，与组织特异性呼吸水平相关。(A类)分离斑马鱼组织群并分析其线粒体DNA含量随时间的变化。所示为SEM的平均dCt值*表示与同一组织组的WT存在显著差异；*P（P）*Mann–Whitney检验≤0.05（折叠变化值、样品尺寸和*P（P）*-值）。(B类)从3 wpf斑马鱼的中枢神经系统组织中测量基础呼吸（黑色）和最大FCCP非耦合呼吸（白色）*表示与WT有显著差异；*P（P）*≤0.05 ANOVA/钢事后测试（平均值、样本大小和*P（P）*-值）。(C类)线粒体DNA含量与中枢神经系统组织的呼吸水平之间存在显著相关性。*波兰^−/−*样品（钻石）聚集在一起，线粒体DNA和呼吸作用较低，而*波兰^+/−*样本（交叉）显示线粒体DNA和呼吸的WT水平（圈）。

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