Human papillomavirus mediated inhibition of DNA damage sensing and repair drives skin carcinogenesis

doi:10.1186/s12943-015-0453-7

.2015年10月29日14时183分。

doi:10.1186/s12943-015-0453-7。

人乳头瘤病毒介导的DNA损伤传感和修复抑制驱动皮肤致癌

马丁·赫夫鲍尔¹, 詹姆斯·库克², Gijsbertus T J van der Horst先生³, 赫伯特·普菲斯特¹, 阿兰·斯托利⁴, 巴基·阿奎尔⁵

附属公司

¹科隆大学病毒学研究所，德国科隆，50935，Furst-Pückler-Str.56。
²皮肤研究中心，Blizard研究所，Barts和伦敦医学与牙科学院，伦敦玛丽女王大学，英国E12AT。
³MGC，遗传系，生物医学遗传学中心，伊拉斯谟大学医学中心，鹿特丹，3000，加利福尼亚州，荷兰。
⁴牛津大学威瑟尔分子医学研究所肿瘤学系，牛津，OX3 9DS，英国。
⁵科隆大学病毒学研究所，德国科隆，50935，Furst-Pückler-Str.56。baki.akguel@uk-koeln.de。

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人乳头瘤病毒介导的DNA损伤传感和修复抑制驱动皮肤致癌

马丁·赫夫鲍尔等。摩尔癌症. 2015.

.2015年10月29日14时183分。

doi:10.1186/s12943-015-0453-7。

作者

马丁·赫夫鲍尔¹, 詹姆斯·库克², Gijsbertus T J van der Horst先生³, 赫伯特·普菲斯特¹, 阿兰·斯托利⁴, 巴基·阿奎尔⁵

附属公司

¹科隆大学病毒学研究所，德国科隆，50935，Furst-Pückler-Str.56。
²皮肤研究中心，Blizard研究所，Barts和伦敦医学与牙科学院，伦敦玛丽女王大学，英国E12AT。
³MGC，遗传系，生物医学遗传学中心，伊拉斯谟大学医学中心，鹿特丹，3000，加利福尼亚州，荷兰。
⁴牛津大学威瑟尔分子医学研究所肿瘤学系，牛津，OX3 9DS，英国。
⁵科隆大学病毒学研究所，德国科隆，50935，Furst-Pückler-Str.56。baki.akguel@uk-koeln.de。

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摘要

背景：未能建立有效的DNA损伤反应来修复紫外线诱导的环丁烷嘧啶二聚体（CPD）导致皮肤鳞状细胞癌（cSCC）的发病倾向增加。高危患者群体，如器官移植受者（OTRs），经常在暴露于紫外线的身体部位表现出现场癌变，多发性人乳头瘤病毒（HPV）相关的cSCC从该部位迅速发展，导致严重的发病率和死亡率增加。体外分子证据表明，β-乳头瘤病毒属HPV（β-PV）在加速皮肤肿瘤发生的早期阶段起着重要作用。

方法：我们通过将K14-HPV8-E6wt小鼠（紫外线治疗后发生皮肤肿瘤）与K14-CPD-光解酶动物杂交，并通过产生K14-HPV8-E6-K136N突变小鼠株，研究了紫外线诱导的β-PV E6癌蛋白驱动的皮肤肿瘤发生小鼠模型中DNA损伤的作用。在紫外线照射后，通过免疫组织化学测定表达E6的原代人角质形成细胞的小鼠皮肤和器官型皮肤培养物中胸腺嘧啶二聚体（CPD的标记物）和γH2AX（DNA双链断裂的标记物）的水平，并通过细胞内蛋白质印迹测定细胞系中的水平。通过Western blots和免疫组织化学方法评估细胞株和器官型皮肤培养物中ATR/Chk1和ATM的磷酸化。

结果：K14-HPV8-E6wt小鼠紫外线照射后皮肤肿瘤的发生可以通过CPD-光解酶的表达完全阻断。通过紫外线照射后表达E6蛋白的细胞中胸腺嘧啶二聚体的定量，并在保守残基处点突变，我们在蛋白的C末端部分确定了一个关键赖氨酸，用于预防DNA损伤修复和p300结合。然而，所有K14-HPV8-E6wt动物在紫外线照射下表达HPV8-E6-K136N突变体后，都会发生皮肤肿瘤，这显著阻止了紫外线照射后皮肤肿瘤的发展。CPD在过度增殖表皮K14-HPV8-E6wt皮肤中的持续存在导致γH2AX病灶的积聚。由于ATM、ATR和Chk1缺乏磷酸化，单层培养和器官型培养的E6阳性细胞的DNA损伤传感受损。

结论：我们发现，表达E6的细胞无法感知并产生修复紫外线诱导的DNA损伤的有效反应，并证明E6介导的DNA损伤修复抑制与肿瘤发生的生理相关性。这些是第一个关于HPV8致瘤性的体内机械数据，并证明病毒E6蛋白对DNA损伤修复途径的损伤是HPV驱动的皮肤致癌的关键因素。

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数字

图1
K14-HPV8-E6wt小鼠CPD修复可消除紫外线诱导的皮肤肿瘤形成。一K14-HPV8-E6wt动物（FVB/n背景）与K14-CPD-PL（FVB/n背景）交配，F1代后代接受紫外线照射。通过将动物暴露在白色荧光灯管中，CPD-PL被重新激活。图中显示了具有代表性的宏观(*上部面板*)和组织学(*下面板，显示放大倍数*)E6的皮肤图像⁻/损益⁻（n） = 11），E6⁻/损益⁺（n） = 11），E6⁺/损益⁻（n） = 11）和E6⁺/损益⁺（n） = 7）紫外线照射后24天的动物b条E6的T^T染色皮肤切片的代表性图像⁺/损益⁻（n） = 3）和E6⁺/损益⁺（n） = 3）紫外线处理和光活化后3天收集的小鼠（放大倍数：640×）

图2
β-PV E6对DNA损伤修复的抑制作用。一使用细胞内Western分析一组HPV5-E6突变体，以检测延迟修复表型。K138N突变体完全阻断了HPV5-E6延缓UVB诱导的T^T修复的能力(n个 = 一式三份；对照组与HPV5-E6wt，**，第页 = 0.0032; HPV5-E6wt与HPV5-C6K138N，**，第页 = 0.0057; 对照组与HPV5-E6-K138N，第页 = 0.07). 数据以平均值表示 ± 扫描电镜。b条代表性宏观图像(*上部面板*)FVB/n-wt的组织学（下面板，放大显示）(n个 = 15），K14-HPV8-E6wt(n个 = 12）和K14-HPV8-E6K136N动物(n个 = 50）紫外线照射24天后服用。**c（c）**显示紫外线照射后发生乳头状瘤的动物百分比的条形图

图3
紫外线照射K14-HPV8-E6小鼠皮肤DNA损伤的持续性。一对FVB/n-wt、K14-HPV8-E6wt和K14-HPV 8-E6K136N小鼠经紫外线处理的皮肤石蜡包埋切片进行T^T染色（放大400倍）。的代表性图像n个 = 显示了每条小鼠线每个时间点的4次皮肤活检。b条T ^ T阳性细胞通过每3个区域的阳性细胞计数进行定量n个 = 每条鼠标线和每个时间点有4只动物。紫外线处理后第1天，在T^T阳性细胞的数量上没有观察到显著差异（FVB/n-wt与K14-HPV8-E6wt，第页 = 0.1094; FVB/n-wt vs.K14-HPV8-E6-K136N，第页 = 0.1769; K14-HPV8-E6wt与K14-HPV 8-E6-K136N，第页 = 0.8115）。治疗三天后，K14-HPV8-E6wt小鼠皮肤中的T ^ T阳性细胞明显增多（FVB/n-wt vs.K14-HPV 8-E6w，***，第页 < 0.0001; FVB/n-wt与K14-HPV8-E6-K136N，***，第页 < 0.0001; K14-HPV8-E6wt与K14-HPV 8-E6-K136N，***，第页 = 0.0003). 数据以平均值表示 ± 扫描电镜

图4
K14-HPV8-E6小鼠紫外线处理皮肤中的DNA损伤。对紫外线处理皮肤的石蜡包埋皮肤切片进行γH2AX染色（放大倍数：400倍）。的代表性图像n个 = 每个时间点显示4次小鼠皮肤活检

图5
E6的表达抑制ATM和ATR的磷酸化。一代表性免疫印迹(n个 = 3）表明HPV5和HPV8 E6在UVB照射24小时或喜树碱治疗4小时后抑制ATR和Chk1磷酸化。通过K138处HPV5-E6突变恢复正常磷酸化模式。ATR和Chk1的总水平不受E6表达的影响。b条HPV8-E6在器官型培养物中的表达延迟了DNA修复和DNA损伤感知。用20 mJ/cm照射平行生长的表达HPV8-E6或pLXSN空载体的培养物²UVB固定前24小时。代表性免疫组织化学染色(n个 = 3）实验表明，对照细胞中ATM和ATR磷酸化，HPV8-E6表达细胞缺乏磷酸化，这与未重配对T的存在有关^∧T型

图6
HPV8-E6K136N损伤p300结合。用空载体Flag-8E6wt或Flag-8E6K136N的表达载体瞬时转染RTS3b细胞的提取物，用M2-Flag-琼脂糖培养。免疫共沉淀p300、MAML1和SMAD3以及10%的输入提取物用特异性抗体进行Western blot检测。通过对Flag标签的Western blot证实HPV8-E6的表达。微管蛋白表达证实蛋白质负荷相等

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