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.2015年10月27日；10（10）：e0141378。
doi:10.1371/journal.pone.0141378。 2015年电子收集。

LRP1、ERK和cAMP信号通路在乳铁蛋白诱导成熟大鼠脂肪细胞脂解中的作用

Keiko Ikoma-Seki先生 1, Kanae Nakamura（中村佳乃） 2, 森田佐夫 2, 小野友治 1, 杉山庆吉 三, Hoyoku Nishino公司 4, 平野久志 5, Michiaki Murakoshi先生 6
附属公司

LRP1、ERK和cAMP信号通路在乳铁蛋白诱导成熟大鼠脂肪细胞脂解中的作用

Keiko Ikoma-Seki先生等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

乳铁蛋白（LF）是一种存在于牛奶中的多功能糖蛋白。一项临床研究表明，牛LF肠溶片可以减少内脏脂肪的积累。此外，动物研究表明，摄入的LF部分输送到肠系膜脂肪，体外研究表明LF促进成熟脂肪细胞的脂解。本研究的目的是确定LF诱导成熟脂肪细胞脂肪分解的机制。为了解决这个问题，我们使用蛋白质组学技术来分析蛋白质表达谱。在暴露于LF后的不同时间收集大鼠肠系膜脂肪原代培养物中的成熟脂肪细胞。蛋白质组学分析表明，对脂解速率限制步骤起催化作用的激素敏感脂肪酶（HSL）的表达水平上调，并且在LF处理细胞后15分钟内HSL被蛋白激酶A激活。我们之前报道过LF增加了细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的浓度，表明LF激活了cAMP信号通路。在本研究中，我们发现细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路的表达水平和活性上调。此外，LF增加转录因子cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的活性，CREB在cAMP和ERK信号通路的下游发挥作用，并调节腺苷酸环化酶和HSL的表达水平。此外，沉默假定的LF受体低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）可以减弱LF处理的脂肪细胞中的脂肪分解。这些结果表明，LF通过LRP1控制cAMP/ERK信号通路的活性，从而调节参与脂肪分解的蛋白质的表达水平，从而促进成熟脂肪细胞的脂肪分解。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：K.Ikoma-Seki、K.Nakamura、S.Morishita、T.Ono和M.Murakoshi是Lion Corporation的员工。H.Nishino和K.Sugiyama收到了Lion Corporation的咨询费。这项工作得到了Lion Corporation的支持，蛋白质组分析部分得到了建立翻译后修饰临床蛋白质组学研究中心（创建“先进跨学科研究领域创新中心”的研究任务）的支持日本教育、文化、体育、科学和技术部创新系统开发项目（ID:11800122）。这不会改变作者对PLOS ONE数据和材料共享政策的遵守。

数字

图1
图1。通过PKA分析LF对HSL和PLIN磷酸化的影响并测定PKA活性。
在存在或不存在1 mg/ml LF的情况下（0 min），检测到PKA对HSL和PLIN的磷酸化作用。显示了归一化为HSL和PLIN蛋白表达水平的磷酸化水平。（A）HSL Ser660和（B）PKA PLIN Ser497。（C）LF处理脂肪细胞中PKA活性的分析。用ELISA检测脂肪细胞在LF治疗前（0分钟）和治疗后的PKA活性。显示了归一化为BCA测定的总蛋白的激酶活性。使用Dunnett的多重比较试验评估每个采样时间的数据与0分钟样品的统计显著性，数据代表三个相同实验之一的三次测定的平均±SD值*第页< 0.05, ***第页<0.001 HSL，激素敏感脂肪酶；LF，乳铁蛋白；PLIN，紫苏素；蛋白激酶A；SD，标准偏差。
图2
图2。LF对ERK1/2和Ras。
（A）用LF处理脂肪细胞后ERK1/2（Thr202/Tyr204）的激活。在存在或不存在（0分钟）1mg/ml LF的情况下检测到磷酸化ERK1/2。显示了归一化为ERK1/2蛋白表达水平的磷酸化水平。（B）经LF处理的脂肪细胞中通过c-Raf激活Ras。在用1mg/ml LF处理之前（0分钟）和之后，使用下拉分析试剂盒（见实验程序）从细胞裂解物中捕获活性Ras。用western blot分析检测从珠子中洗脱出的活性Ras。强度水平标准化为BCA测定的总蛋白。使用Dunnett的多重比较试验评估每个采样时间的数据与0分钟样品的统计显著性，数据代表三个相同实验之一的三次测定的平均±SD值*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001. ERK，细胞外信号调节激酶；LF，乳铁蛋白；SD，标准偏差。
图3
图3。LF对CREB激活的影响分析。
（A）LF处理的脂肪细胞中CREB-Ser133的磷酸化。在存在或不存在1 mg/ml LF的情况下（0分钟）检测到磷酸化CREB。磷酸化水平归一化为CREB的蛋白表达水平。蛋白质表达水平的变化（B）HSL和（C）存在或不存在1 mg/ml LF（0 min）时的AC异构体（AC1、2和6）归一化为β-actin的蛋白表达水平。使用Dunnett的多重比较试验评估每个采样时间的数据与0分钟样品的统计显著性，数据代表三个相同实验之一的三次测定的平均±SD值*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001. 腺苷酸环化酶；CREB、cAMP反应元件结合蛋白；激素敏感脂肪酶；LF，乳铁蛋白；SD，标准偏差。
图4
图4。PKA活性抑制对下游因子CREB的影响。
在用1mg/ml LF（含或不含选择性PKA抑制剂H-89）治疗15分钟后，检测CREB-Ser133的磷酸化水平。在添加LF前30分钟，在H-89中预先培养脂肪细胞。磷酸化水平归一化为CREB蛋白表达水平。使用Student评估LF处理与未处理样本数据差异的统计显著性t吨测试**第页<0.01，不另作说明。；无显著差异。数据表示三个相同实验之一的三次测定的平均值±SD。LF，乳铁蛋白；PKA，蛋白激酶A:CREB，cAMP反应元件结合蛋白：HSL，激素敏感脂肪酶：SD，标准偏差。
图5
图5。PKA活性抑制对HSL表达水平和LF脂解的影响。
（A）LF引起的HSL表达水平的变化。在用1mg/ml LF（含或不含选择性PKA抑制剂h-89）治疗3 h后检测HSL的蛋白表达水平。变化归一化为β-肌动蛋白表达水平。使用Student’st吨试验，数据表示三个相同试验之一的三次测定的平均±SD值*第页< 0.05, **第页< 0.01.（B）LF激活脂肪分解。在用1mg/ml LF（含或不含选择性PKA抑制剂H-89）处理后，分析培养基中甘油的量，以量化脂肪分解。使用Dunnett的多重比较试验评估数据与LF未处理细胞的统计显著性*第页< 0.05, **第页< 0.01. 数据表示三个相同实验之一的三次测定的平均±SD值。LF，乳铁蛋白；SD，标准偏差。
图6
图6。LF诱导LRP1诱导脂肪细胞的脂肪分解。
（A）LF激活脂肪分解。为了定量脂肪分解，在添加1 mg/ml LF后24 h分析培养基中的甘油量。使用Studentt吨测试**第页< 0.01. 数据表示三个相同实验之一的三次测定的平均±SD值。（B）LF处理激活HSL。添加LF 15分钟后，在有或无1 mg/ml LF的情况下检测到HSL磷酸化。显示了归一化为蛋白质表达水平的磷酸化水平。使用学生t吨试验与LF未处理对照**第页< 0.01; 不另作说明，无显著差异。数据表示三个相同实验之一的三次测定的平均±SD值。（C）通过siRNA沉默LRP1。用阴性对照siRNA（siNC）或LRP1-siRNA（siLRP1）瞬时转染脂肪细胞（见材料和方法）。在每次检测期间，通过免疫印迹法监测LRP1蛋白的表达。显示了不同的数据。β-actin作为负荷对照。激素敏感脂肪酶；LF，乳铁蛋白；脂蛋白受体相关蛋白1；SD，标准偏差。
图7
图7。βAR阻滞剂对脂解诱导剂活性的影响。
（A）ISO在有或无βAR抑制剂的情况下激活脂肪细胞中的脂肪分解。在添加0.1 mM ISO和或不添加阿替洛尔（β1AR阻滞剂）定量脂肪分解。使用Student’st吨测试***第页<0.001，不另作说明。；无显著差异。数据表示三个相同实验之一的三次测定的平均±SD值。（B）使用或不使用βAR抑制剂通过LF激活脂肪分解。在添加1 mg/ml含有或不含有阿替洛尔（β1AR阻滞剂）定量脂肪分解。使用Student’st吨测试*第页< 0.05,† 第页<0.1，不另作说明。；无显著差异。数据表示三个相同实验之一的三次测定的平均±SD值。LF，乳铁蛋白；SD，标准偏差。
图8
图8。描述LF诱导成熟脂肪细胞脂肪分解的假设模型。
T、 转录；P、 磷酸化；实心箭头，直接相互作用；虚线箭头，间接交互。腺苷酸环化酶；CREB、cAMP反应元件结合蛋白；ERK，细胞外信号调节激酶；Gα秒，G秒α亚单位；激素敏感脂肪酶；LF，乳铁蛋白；低密度脂蛋白受体相关蛋白1；蛋白激酶A；PLIN、紫苏素。
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出版物类型

赠款和资金

KI、KN、SM、TO和MM是Lion Corporation的员工。HN和KS收到了Lion Corporation的咨询费。这项工作得到了Lion Corporation的支持，尤其是蛋白质组学分析部分得到了建立翻译后修饰临床蛋白质组学研究中心（创建“先进跨学科研究领域创新中心”的研究任务）的支持日本教育、文化、体育、科学和技术部创新系统开发项目（ID:11800122）。Lion Corporation参与了研究设计、研究实施、数据收集、数据解释或报告编制，而成立翻译后修饰临床蛋白质组学研究中心则参与了研究的设计、研究进行、数据收集和，蛋白质组分析部分的数据解释或报告准备。