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.2015年10月19日；60(1):168-79.
doi:10.1128/AAC.01632-15。 打印2016年1月。

抗逆转录病毒药物、甲基苯丙胺和HIV-1包膜蛋白gp120破坏神经能量平衡，并伴有不同程度的突触和神经炎损伤

安娜·B·桑切斯 1, 朱塞佩·P·瓦拉诺 1, 赛勒斯·M·德罗齐尔 1, 瑞奇·蒙 1, 艾琳·C·加泰罗尼亚语 1, 卡里·C·道林 1, 纳塔莉亚·塞布克 1, 梅兰妮·M·霍弗 1, 马库斯·考尔 2
附属机构

抗逆转录病毒药物、甲基苯丙胺和HIV-1包膜蛋白gp120破坏神经能量平衡，并伴有不同程度的突触和神经炎损伤

安娜·B·桑切斯等。 抗菌剂Chemother. .

摘要

尽管联合抗逆转录病毒治疗（cART），HIV-1感染仍经常导致HIV-相关神经认知障碍（HAND）。越来越多的证据表明，长期接触cART的成分本身可能具有神经毒性。此外，滥用甲基苯丙胺等精神刺激剂似乎会加重HAND，并损害抗逆转录病毒治疗。然而，人们对病毒、娱乐和治疗药物对大脑的综合影响知之甚少。因此，我们将混合神经胶质大脑皮层细胞暴露于四种不同药理学类别的抗逆转录病毒药物（齐多夫定[AZT]、奈韦拉平[NVP]、沙奎那韦[SCV]和118-D-24），并暴露于甲基苯丙胺，在一些实验中，暴露于HIV-1 gp120蛋白24小时和7天。随后，我们使用神经元树突和突触前终末的特异标记物，通过荧光显微镜评估神经元损伤。我们还分析了神经元ATP水平的紊乱，并通过免疫荧光和Western blotting评估了自噬的参与。抗逆转录病毒药物主要在7天的孵育期间引起神经突起和突触前终末的改变，这取决于特定化合物及其与去氧麻黄碱的组合。同样，神经元ATP的丢失对每种药物或其组合都是特定的，无论是否含有甲基苯丙胺或病毒gp120。ATP的丢失与AMP-activated protein kinase（AMPK）的激活和自噬有关，然而，自噬无法恢复神经元ATP的正常水平。相反，雷帕霉素促进自噬可防止在cART与甲基苯丙胺或gp120联合使用期间ATP的长期下降。我们的研究结果表明，cART对HIV感染的总体积极影响伴随着可检测到的神经毒性，而甲基苯丙胺可能会加剧这种神经毒性。

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数字

图1
图1
暴露24小时期间大脑皮层神经元中抗逆转录病毒药物引起的神经毒性。将混合神经胶质脑皮层细胞培养物暴露于不同浓度的齐多夫定（AZT）、奈韦拉平（NVP）、沙奎那韦（SQV）和整合酶抑制剂118-D-24（IntInh）（A）或ARV药物组合（B）中24 h。NMDA（300μM）仅在孵育开始时使用20分钟，以诱导兴奋毒性。如材料和方法所述，使用神经元MAP-2、突触素和核DNA的荧光染色分析神经元损伤和死亡。样本来自至少三个独立实验，每个条件下重复次数≥15次。数值为平均值±SEM.*，P（P）与对照组相比<0.05（ANOVA和Fisher's PLSD事后（post-hoc）测试）。
图2
图2
METH和ARV药物存在下24小时和7天大脑皮层细胞的神经损伤。将大脑皮质细胞培养物与单一药物或不同抗逆转录病毒药物（10μM AZT、1μM NVP、50 nM SQV和/或20μM IntInh）和METH（100μM）的组合培养24小时或7天。根据材料和方法中的描述，使用神经元MAP-2（顶部）和SYP（底部）的荧光染色和显微镜分析神经元损伤。样本来自至少三个独立实验，每个条件下七个重复。*，P（P）与对照组（24小时）相比<0.05；†，P（P）与对照组（7天）相比<0.05（ANOVA和Fisher's PLSD事后（post-hoc）测试）。
图3
图3
暴露于METH和ARV药物24小时和7天的大脑皮层神经元的免疫荧光染色。大脑皮质细胞培养物与抗逆转录病毒药物（10μM AZT、1μM NVP、50 nM SQV和20μM IntInh）和METH（100μM）联合培养。在24小时和7天的处理后，细胞被固定、渗透并染色MAP-2（A）和突触素（B）。如材料和方法所述，使用显微镜分析图像。棒材，20μm。箭头表示零散进程的示例。
图4
图4
METH和ARV药物存在24小时和7天的神经毒性，通过大脑皮层细胞中的ATP水平进行测量。将大脑皮质细胞培养物与单一药物或抗逆转录病毒药物（10μM AZT、1μM NVP、50 nM SQV和/或20μM IntInh）和METH（100μM）的组合培养24小时或7天。使用ATPlite试剂盒测量混合的神经胶质和神经胶质培养物的ATP水平。分析分四个重复进行，实验重复三次。*，P（P）与对照组（24小时）相比<0.05；†，P（P）与对照组（7天）相比<0.05（ANOVA和Fisher's PLSD事后（post-hoc）测试）。
图5
图5
长期接触ARV药物、METH和HIV-1 gp120的神经毒性效应。将大鼠大脑皮质细胞培养物与抗逆转录病毒药物（ARV、10μM AZT、1μM NVP、50 nM SQV和20μM IntInh）、METH（100μM）和BaL gp120（200 pM）联合培养7天。使用ATPlite试剂盒测量混合的神经胶质和神经胶质大脑皮层细胞培养物的ATP水平。分析分八个重复进行，实验重复三次。*，P（P）与对照组相比<0.05（ANOVA和Fisher's PLSD事后（post-hoc）测试）。
图6
图6
METH、gp120和ARV药物改变大鼠大脑皮层细胞的自噬。联合使用抗逆转录病毒药物（ARV、10μM AZT、1μM NVP、50 nM SQV和20μM IntInh）、METH（100μM）和BaL gp120（200 pM）处理大鼠大脑皮层细胞。七天后，制备细胞溶质提取物，并使用针对以下蛋白质的抗体通过Western blotting进行分析：磷酸和总AMPK（A）、LC3（B）、p62/SQSTM1（C）以及磷酸和总4E-BP1（D）。总β-肌动蛋白作为负载对照。直方图显示了四到八个独立实验的密度分析结果。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）<0.001（方差分析和Fisher's PLSD事后（post-hoc）测试）。
图7
图7
接触METH、gp120和ARV药物的神经元中LC3和自噬颗粒结构的定位。将大鼠大脑皮质细胞培养物与抗逆转录病毒药物（ARV、10μM AZT、1μM NVP、50 nM SQV和20μM IntInh）、HIV-1 BaL gp120（200 pM）和METH（100μM）联合培养7天。雷帕霉素（20 nM）被用作诱导自噬的阳性对照。如材料和方法中所述，将细胞固定、渗透并荧光染色LC3（FITC）和MAP-2（罗丹明红）作为神经元标记物。红色和绿色信号的重叠在合并图像中显示为黄色。棒材，20μm。箭头表示自噬体的例子。
图8
图8
在雷帕霉素存在下长期接触ARV药物、HIV-1 gp120和METH期间神经元ATP水平的恢复。在联合抗逆转录病毒药物（ARV、10μM AZT、1μM NVP、50 nM SQV和20μM IntInh）、BaL gp120（200 pM）和METH（100μM）治疗开始后，在有或无雷帕霉素（20 nM）的情况下，将大脑皮质细胞培养物培养24小时（A）和7天（B）。使用ATPlite试剂盒测量混合胶质和神经胶质脑皮质细胞培养物的ATP水平。每个条件下的样品重复五到七次。*，P（P）与对照组相比<0.05（不含雷帕霉素[R−]）；†，P（P）与对照组（雷帕霉素[R+]）相比<0.05（ANOVA和Fisher’s PLSD事后（post-hoc）测试；n个=每24小时和7天3次）。请注意，尽管添加了雷帕霉素，但暴露于ARV鸡尾酒或gp120的培养物神经元中的ATP水平仍显著低于对照水平。
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