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.2015年9月17日;2(4):ENEURO.0019-15.2015。
doi:10.1523/ENEURO.0019-15.2015。 eCollection 2015年7月至8月。

绒猴新皮质树突状棘的体内双光子成像

附属公司

绒猴新皮质树突状棘的体内双光子成像

奥萨穆·萨达卡内等。 电子神经. .

摘要

双光子显微镜结合人工表达荧光蛋白的技术,可以直接观察活体大脑中的树突棘。然而,由于缺乏合适的标记技术来可视化树突棘,这种方法在灵长类动物大脑中的应用受到了阻碍。在这里,我们开发了一种基于腺相关病毒载体的荧光蛋白表达系统,用于可视化绒猴新皮质体内的树突棘。为了清晰地显示每个脊柱,报告荧光蛋白的表达应该既稀疏又强烈。为了满足这些要求,我们使用四环素反式激活物(tTA)-四环素反应元件系统,并通过滴定Thy1S启动子驱动的tTA的数量来扩增荧光信号,以实现稀疏表达。通过这种方法,我们能够在活体内通过双光子显微镜观察绒猴皮层中的树突棘,并分析前额叶皮层中棘的周转。我们的结果表明,绒猴皮层中的短棘往往比长棘变化更频繁。体内样本与固定样本的比较表明,我们的方法并没有检测到所有现有的脊椎。虽然我们发现胶质细胞增殖,但从有或无窗口构建的样本的脊柱长度比较来看,窗口构建对组织的损伤相对较小。我们新的双光子成像标记技术可用于检测灵长类动物的回路重组和突触可塑性。

关键词:枝晶;绒猴;新皮质;灵长类动物;脊椎。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1。
图1。
Thy1S启动子驱动绒猴皮层hrGFP的稀疏表达。一个,病毒结构示意图。B类用双光子显微镜观察固定脑标本中不同浓度病毒注射后hrGFP的表达。左,低浓度;中等浓度;对,高度集中。注意不同浓度下标记细胞密度的差异。左、中、右面板的最大强度投影分别为71、71和51片,间隔为5µm。比例尺,100µm。
图2。
图2。
成像窗口的构造。一个体感皮层周围靶区的颅骨切开术和硬膜切开术。显示了绒猴皮层的暴露靶区。比例尺,500µm。B类,本研究中使用的金属板插图。C类,图片显示了固定在绒猴头部的金属板。比例尺,10 mm。D类,实验时间表。
图3。
图3。
树突棘成像体内双光子显微镜。一个,获取的图像的最大强度投影体内绒猴皮层的双光子成像。B类,同一场地图像三维重建侧视图一个.所示区域的深度F类G公司用虚线表示。C类,软脑膜表面附近的图像平面。D类,中方框区域的放大图像C类.E类,中方框区域的放大图像D类显示树突棘。F类,深度为220µm的图像平面显示体细胞和基底树突。G公司,深度为330µm的成像平面。比例尺:一个B类100µm;C类,50微米;D类,5微米;E类,2微米;F类G公司,50µm。
图4。
图4。
前额叶皮质棘的时间成像。一个每隔24小时对前额叶皮层的相同树突状区域进行成像。顶部面板显示第0天(开颅术后7天)采集的图像,底部面板显示第1天采集的图像。比例尺,5µm。B类,通过手动检查每隔24小时采集的两张图像来识别获得的脊椎。填充的矩形表示获得的脊椎示例的位置。比例尺,1µm。C类,与B类因为失去了脊椎。实心三角形表示丢失脊椎的位置。D类,显示脊柱周转率的方框图。方框图中的开放圆圈表示平均值。黑点表示每个站点的值。晶须延伸至四分位范围1.5倍内的最大值和最小值。E类,脊柱长度在持续、增加和减少种群中的累积分布。
图5。
图5。
神经胶质细胞的激活。一个,用抗GFAP抗体免疫组织化学染色的样品的共焦图像。比例尺,500µm。B类,中左侧方框区域的放大图像一个,注射部位附近。C类,中右侧方框区域的放大图像一个,距离注射部位较远。比例尺,200µm。D类,用抗Iba1抗体免疫组织化学染色的样品的共焦图像。比例尺,500µm。E类,中左侧方框区域的放大图像C类,靠近注射部位。F类,中右侧方框区域的放大图像C类,距离注射部位较远。比例尺,200µm。
图6。
图6。
树突棘的比较体内体外观察。一个,共聚焦图像体外染料注入样品。比例尺:顶部,100µm;底部,5µm。B类,显示脊柱密度的方框图体内体外人口。方框图中的开放圆圈表示平均值。黑点表示每个站点的值。晶须延伸至四分位范围1.5倍内的最大值和最小值。C类,脊椎密度体内、染料注入和IHC样品。D类,脊柱长度的累积分布体内体外条件。

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引用人

工具书类

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