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.2015年10月8日；11（10）：e1005173。
doi:10.1371/journal.ppat.1005173。 eCollection 2015年10月。

母婴双生子流感传播导致严重疾病、乳腺感染和通过调节宿主反应的发病机制

Stéphane G Paquette酒店 1, 大卫·班纳 2, 斯蒂芬·S·H·黄 三, 拉奎尔·阿尔曼萨 4, 阿尔贝托·莱昂 2, 徐罗玲 2, 杰西卡·巴托斯科 5, 大卫·J·开尔文 6, 艾莉森·开尔文 7
附属机构

母婴双生子流感传播导致严重疾病、乳腺感染和通过调节宿主反应的发病机制

圣潘·G·帕奎特等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

季节性流感病毒通常仅限于人类上呼吸道，而具有较大致病潜力的流感病毒通常也以肺外器官为目标。婴儿、孕妇和哺乳期母亲在流感病毒感染后极易患严重呼吸道疾病，但母婴二人组疾病严重程度的机制尚不清楚。在这里，我们利用我们开发的婴儿-母亲雪貂流感模型调查了2009年H1N1流感病毒在哺乳期母亲和婴儿中的感染和传播。婴儿感染后出现严重疾病和死亡率。病毒从婴儿传播给母貂导致肺部感染和母亲死亡。在乳腺组织中也发现了活病毒，并表达了母亲的乳汁，最终导致了断奶。组织病理学显示腺泡腺泡结构破坏，缺乏乳汁。病毒定位于阳性腺体的乳腺上皮细胞。为了了解乳腺感染的分子机制，我们进行了全局转录分析，结果显示，泌乳素等产奶基因下调，STAT5到STAT3信号转导指示乳腺退化途径增加。与癌症发展相关的基因也显著增加，包括JUN、FOS和M2巨噬细胞标记物。乳腺内的免疫反应以淋巴细胞相关基因CD3e、IL2Ra、CD4减少和IL1β上调为特征。将H1N1直接接种到乳腺会导致婴儿呼吸道感染和婴儿死亡，这表明流感病毒能够在乳腺组织中复制，并且可能通过母乳喂养传播。对人类乳腺细胞的体外感染研究显示出对H1N1病毒感染的敏感性。总之，我们已经表明，母婴二元体内流感病毒感染的宿主-猪相互作用在乳腺内启动免疫和致癌信号级联。这些发现表明，乳腺在感染和免疫方面的作用可能比先前认为的更大。

PubMed免责声明

利益冲突声明

我读过该杂志的政策，这份手稿的作者有以下竞争兴趣：Alyson Kelvin是免疫诊断和研究的一名员工。David Kelvin是IDR的股东。本研究不涉及任何商业产品或利益。这不会改变我们对所有PLOS病原体共享数据和材料政策的遵守。

数字

图1
图1。2009年幼貂的鼻内H1N1感染导致母貂和幼貂严重疾病和死亡。
母婴二元接种实验设计示意图(A类). 婴儿鼻内接种2009年H1N1流感A/Cal毒株（105EID公司50)和他们的护理人员住在一起。温度(B类)和重量(C类)婴儿接种后14天内进行记录。对照模拟接种婴儿（灰色线）用于评估生长中婴儿的自然波动。母亲和婴儿的存活率在14天内确定(D类). 结果显示了3种独立窝仔接种/感染（3只母鼬和19只幼鼬）和3种窝仔模拟接种（3只母鼬和11只幼貂）的平均值或代表性。*表示通过ANOVA确定的p值小于0.05，将2009年接种/感染的H1N1病毒与模拟对照进行比较。误差条指示+/-SE。
图2
图2。婴儿向母雪貂传播H1N1流感会导致上下呼吸道感染，且具有显著的病理学特征。
接种婴儿（A/Cal H1N1流感（105EID公司50))和他们的保姆住在一起。每天收集婴儿和母亲的鼻腔冲洗液。用MDCK滴定法测定鼻腔冲洗液（NW）中的活病毒载量(A类)以及特定时间点的母亲气管和母亲肺部(B类). 婴儿接种后第3/4天和第7天，从接种婴儿的护理人员和直接接种成年雪貂的护理人员那里采集肺部，进行苏木精和伊红（H&E）组织病理学评估，作为对照(C类). 绿色箭头表示细胞密集堆积；黑色箭头表示弥漫性免疫细胞浸润。由于广泛浸润，第7天成人组织中未包括黑色箭头。使用德国新湖徕卡生物系统公司的Aperio ScanScope XT进行高分辨率扫描。母亲图像的左栏和中栏表示每个肺部扫描的低倍和高倍放大。比例尺指示相对100μm。第个结果，共个A类代表了3次独立的窝次接种，每天从3名母亲和9名婴儿（每窝3次）收集鼻腔冲洗液。第个结果，共个B类和C类来自连续组织采集的6次独立的窝次接种（第3/4天采集的3次和第7天采集的三次）。误差条显示+/-标准偏差。模拟：母雪貂哺乳模拟饲养的4周龄幼雪貂。结果显示了独立窝次接种/感染的平均值或代表性。
图3
图3。母雪貂2009年H1N1流感经鼻感染会导致严重疾病和病毒传播给母乳喂养的婴儿。
护理人员经鼻接种2009年H1N1流感Cal/07株（105EID公司50)和他们喂养的婴儿住在一起(A类). 温度(B类)和重量(C类)每天记录母亲和婴儿接种后的情况。灰色线条表示模拟接种了疫苗的母亲。母婴接种后的存活率(D类). 通过鼻洗液（NW）的MDCK滴定法定量病毒活载量(E类)和婴儿肺(F类)在整个感染过程中收集的匀浆（已达到断奶期或因病死亡的婴儿）。*表示通过ANOVA确定的p值小于0.05，将接种的H1N1病毒与模拟对照进行比较。误差条显示+/-标准偏差。数据是从三个独立的婴儿接种/感染（3名接种/感染母亲、16名婴儿和3名模拟接种/感染的母亲）中收集的，结果显示平均值或代表接种/感染。
图4
图4。2009年，母亲向婴儿传播甲型H1N1流感导致严重的下呼吸道疾病。
对从对照婴儿和接种护士的婴儿采集的肺部进行组织病理学评估。通过苏木精伊红染色评估组织形态学。数据是从三个独立的窝产儿接种/感染中收集的（3名接种/感染的母亲、16名婴儿和3名模拟接种/感染母亲），结果代表了接种/感染。pmi=热损伤后
图5
图5。哺乳2009年H1N1感染婴儿的母亲乳腺中的病毒复制和病理学。
婴儿雪貂经鼻接种A/Cal，与母雪貂一起饲养7天，收集乳腺、乳汁、血液和粪便，如示意图所示(A类). 通过MDCK滴定均质乳腺组织定量活病毒(B类)，乳头(C类)、和表达乳(D类)来自鼻内接种幼貂的护理妈妈。对2009年H1N1病毒RNA（vRNA）的表达乳进行qRT-PCR(E类). 婴儿粪便中的病毒也通过qRT-PCR检测（直接接种后）(F类)以及婴儿、母亲和成年雪貂的血液（接种后3/4天）(G公司). ND=未检测到。每个时间点至少从3名接种/感染婴儿和3名母亲的独立窝产儿中采集和分析样本。结果显示平均值或代表每个时间点3窝幼崽。雪貂妈妈每次怀孕/产后活动的乳腺数量各不相同。
图6
图6。感染婴儿的母亲乳腺中腺泡的破坏和病毒蛋白的积累。
通过H&E（左）和IHC对感染婴儿的哺乳母亲的石蜡包埋乳腺切片进行IAV（右）分析，确定病理破坏。黑色箭头表示通过抗IAV染色确定的病毒表达区域。黄色箭头表示白细胞浸润区域。蓝色箭头表示牛奶蛋白质积累。绿色箭头表示活跃的上皮细胞层。对照组=模拟接种婴儿的哺乳母亲的乳腺。每个时间点至少从3名接种/感染婴儿和3名母亲的独立窝产儿中采集和分析样本。结果显示，每个时间点有3窝幼崽具有代表性。雪貂妈妈每次怀孕/产后活动的乳腺数量各不相同。
图7
图7。2009年H1N1病毒阳性乳腺具有明显的基因特征，与产奶量、癌症和免疫反应的调节有关。
H1N1+MGs全球表达分析的聚类图显示了每个聚类中最突出的功能群(A类). 产生了特定信号通路和基因网络的H1N1+MG基因表达的聚类图（在方法中描述）(B类). 通过比较2009年H1N1感染的成年雪貂肺和H1N1+MG的基因表达谱来分析免疫应答(C类). 利用在雪貂乳腺或肺中表现出统计显著差异调节的基因生成免疫反应分析的聚类图。显示了在第3/4天和第6/7天显著上调（红色）和下调（红色）基因亚群中KEGG定义的信号级联的基因富集分数(D类). 高于阈值（α=0.05）的值表示在给定时间点上调或下调的基因亚群之间具有统计学意义的富集。从每个时间点的3个接种/感染婴儿和3位母亲的独立产仔试验中收集和分析样本。
图8
图8。STAT5蛋白减少，STAT3蛋白核定位于H1N1+乳腺。
IHC于婴儿接种后第7天在对照组和H1N1+MG中观察STAT5（右面板）和STAT3（左面板）蛋白表达。使用德国纽罗什莱卡生物系统公司的Aperio ScanScope XT进行高分辨率扫描，对感染婴儿的护理母亲的石蜡包埋乳腺切片进行IHC分析，这些切片被STAT5或STAT3抗体染色。插图显示扫描图像的放大倍数，以显示细胞细节。比例尺指示100μm或10μm。这些图像显示了从婴儿鼻内病毒或模拟接种物（每个接种物三次）中采集的乳腺的代表性。
图9
图9。将流感病毒接种到哺乳期雪貂的活动乳腺会导致婴儿呼吸道感染、严重疾病和死亡。
图示为乳腺接种设计示意图(A类). 2009年H1N1（粉色线）或PBS（浅灰色线）乳腺接种后哺乳母雪貂的温度（左侧面板）和重量（右侧面板）(B类). 哺乳期母亲接种2009年H1N1（粉色线）或PBS（浅灰色线）乳腺后喂养的婴儿的温度（左侧面板）和体重（右侧面板）(C类). 2009年乳腺H1N1病毒接种后母貂和幼貂的存活率(D类). 婴儿和母亲鼻腔冲洗液中活病毒载量的测定(E类)以及从表达的牛奶中脱落的活病毒(F类)乳腺接种2009年H1N1流感后。*表示通过方差分析确定的p值小于0.05。误差条显示+/-标准偏差。结果是三个独立乳腺接种试验（3个乳腺接种母亲，18个婴儿）和模拟乳腺接种对照（3个乳房模拟接种母亲，21个婴儿）的平均值或代表值。
图10
图10。流感病毒感染乳腺会导致停乳和腺体结构破坏。
对照组和2009年H1N1疫苗接种乳腺的高分辨率扫描（H&E）(A类). 2009年H1N1病毒和载体接种乳腺组织产奶基因的qRT-PCR图谱(B类). *** 表示p值小于0.001。从三个独立的乳腺接种试验（3名乳腺接种母亲，18名婴儿）和模拟乳腺接种对照（3名乳房模拟接种母亲，21名婴儿）中收集和分析数据。显示的结果显示了3种乳腺接种的数据或具有代表性。
图11
图11。人类“正常”乳腺上皮细胞和腺癌乳腺上皮细胞对2009年H1N1病毒感染敏感且易受感染在体外.
接种于MOI为1的接种A/Cal（H1N1）的乳腺上皮细胞（MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A细胞）于接种后24小时固定，并染色丝状肌动蛋白（红色）、DNA（绿色）和流感病毒NP蛋白（蓝色），并通过共聚焦显微镜成像(A类). 在接种后3、24、48和72小时收集接种在MOI为1和A/Cal（H1N1）的乳腺上皮细胞（MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A细胞），通过qRT-PCR定量病毒RNA片段7(B类)，细胞活力测定(C类)和上清液中活病毒定量(D类). 共聚焦图片是三个独立实验的代表。白色箭头表示流感NP蛋白的核定位。黄色箭头显示病毒沿着质膜萌发。BC，基线控制。
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