A splicing variant of Merlin promotes metastasis in hepatocellular carcinoma

doi:10.1038/ncomms9457

.2015年10月7日6:8457。

doi:10.1038/ncomms9457。

Merlin剪接变异体促进肝细胞癌转移

扎伊·李洛^1 2, 舒群成^三, 解石^三, 张慧璐¹, 村镇张^三, 陈海阳¹, 毕俊秋⁴, 梁唐¹, 胡从立¹, 王宏扬（音）^1 4, 钟莉^5 6

附属公司

¹第二军医大学东方肝病外科研究所/医院信号转导国际合作实验室，上海市长海路225号，200433，中国。
²复旦大学生物医学研究所，上海医学院路138号，邮编200032。
^三中国上海市长海路225号第二军医大学东方肝胆外科研究所/医院外科，邮编：200433。
⁴上海交通大学医学院仁济医院，上海市浦江路160号，200127，中国。
⁵河南科技大学第一附属医院肿瘤研究所肿瘤科，洛阳市京华路24号，邮编471003。
⁶中国上海市千阳路75号上海工程细胞治疗研究中心，邮编：201805。

PMID： 26443326
预防性维修识别码：项目经理4633634
内政部： 10.1038/ncomms9457

Merlin剪接变异体促进肝细胞癌转移

扎伊·李洛等。国家通讯社. 2015.

.2015年10月7日6:8457。

doi:10.1038/ncomms9457。

作者

扎伊·李洛^1 2, 舒群成^三, 解石^三, 张慧璐¹, 村镇张^三, 陈海阳¹, 毕俊秋⁴, 梁唐¹, 胡从立¹, 王宏扬（音）^1 4, 钟莉^5 6

附属公司

¹第二军医大学东方肝病外科研究所/医院信号转导国际合作实验室，上海市长海路225号，200433，中国。
²复旦大学生物医学研究所，上海医学院路138号，邮编200032。
^三中国上海市长海路225号第二军医大学东方肝胆外科研究所/医院外科，邮编：200433。
⁴上海交通大学医学院仁济医院，上海市浦江路160号，200127，中国。
⁵河南科技大学第一附属医院肿瘤研究所肿瘤科，中国洛阳市京华路24号，471003。
⁶中国上海市千阳路75号上海工程细胞治疗研究中心，邮编：201805。

PMID： 26443326
预防性维修识别码：下午4点633634分
内政部： 10.1038/ncomms9457

摘要

由肿瘤抑制基因Nf2编码的Merlin在肿瘤发生和转移中起着关键作用。然而，对于梅林剪接形式的功能重要性知之甚少。在这项研究中，我们发现Merlin在人类肝细胞癌（HCC）中呈低水平，尤其是在转移性肿瘤中，它与不良预后相关。令人惊讶的是，缺少外显子2、3和4的Merlin剪接变异体（（Δ2-4）Merlin）在肝癌和门静脉癌栓（PVTT）标本以及从PVTT衍生的CSQT2细胞系中扩增。我们的研究表明，（Δ2-4）Merlin干扰野生型Merlin结合β-catenin和ERM的能力，并且它在细胞质中而不是在细胞表面表达。此外，（Δ2-4）Merlin过表达增加了β-catenin和干细胞相关基因的表达水平，诱导上皮-间质转化表型，促进体外细胞迁移和体内肺转移的形成。我们的结果表明，（Δ2-4）Merlin变体破坏了Merlin的正常功能并促进肿瘤转移。

PubMed免责声明

数字

**图1。Merlin在HCC和PVTT中的低表达与恶性肿瘤预后相关。**
(一)肝癌组织微阵列切片中Merlin表达降低，PVTT表达降低。Merlin在邻近肿瘤组织、无PVTT的肿瘤组织、有PVTT和PVTT组织的肿瘤组织中染色（放大倍数：×100；小方形放大倍数：x 400）。(b条)TMA中的梅林染色分数（0-5表示不同程度的IHC染色；5表示最大程度，0表示最小程度）。数据显示为平均值±标准差，148例HCC伴PVTT，37例HCC无PVTT和29例肿瘤邻近组织标本*对<0.05; **对<0.01，基于单因素方差分析。(**c（c）**)来自八对具有PVTT的HCC肿瘤和使用Merlin抗体的肿瘤邻近组织的Merlin蛋白的蛋白质印迹。面板下方显示了相对于GADPH的波段量化。(d日)根据148例肝癌患者Merlin的表达情况，对其进行5年随访，得出无病生存率和总生存率**对<0.01，基于学生的t吨-测试。

**图2。干扰Merlin的表达可促进肝癌细胞株的转移。**
(一)用所示抗体对转染Merlin shRNAs的HCCLM3细胞的裂解液进行免疫印迹。(b条)生成shMerlin稳定的HCCLM3、Huh7和L02细胞系。(**c（c）**)Transwell和(d日)侵袭实验检测肝癌细胞的迁移和侵袭能力。下方窗格中显示了各自的渗透单元编号。（比例尺，50 μM）。结果显示为平均值±标准差。，n个=3. **对<0.01***对<0.001，基于学生的t吨-测试。(**e（电子）**)显示了各组在13周时处死的BALB/C小鼠的代表性肺组织切片（H&E；放大倍数：×100，比例尺，300 μM）。箭头表示肺转移瘤（下图）。每组每个肺的平均肺转移瘤数(n个=5）计算（上面板）。结果显示为平均值±s.d。，n个=5. **对<0.01，基于学生的t吨-测试。(**（f）**)处理Huh7细胞*在体外*使用GTPγS或GDP激活Rho和Cdc42。细胞裂解物（50 1时为μl 毫克毫升⁻¹)Western blotting显示shMerlin细胞系和对照组中的活性Rho和Cdc42水平。

**图3。通过PCR和western blotting检测肝癌中Merlin的选择性剪接。**
(一)的表达式*编号2*HCC、无PVTT的HCC和有PVTT组织的HCC中的基因。(b条)检测*NF2型*通过从肝癌、癌旁组织和PVTT组织设计的引物*编号2*外显子1和5。(**c（c）**)的拼接模式*编号2*在正常肝脏中，HCCLM3、Huh-7、CSQT2和L02细胞。(d日)通过抗体（C-18和C-19）检测Merlin及其突变体在HCC细胞系（CSQT2、Huh-7、HCCLM3和HepG2细胞）和肝细胞L02细胞中的表达。(**e（电子）**)检测^重量梅林和^Δ2–4梅林受不同抗体的影响。(**（f）**)用抗体C-18检测Merlin及其突变体在HCC、PVTT和肿瘤邻近组织中的表达。(克)检测^Δ2–4梅林特异性抗体^Δ2–4梅林（Merlin-N15）。(小时)检测^Δ2–4Merlin N15抗体检测HCC、PVTT和肿瘤邻近组织中的Merlin。T：肝癌；N：非肿瘤邻近组织；P： PVTT；M/G：Merlin/GAPDH密度。

**图4。^Δ2–4Merlin表达促进细胞迁移并诱导EMT。**
(一)^Δ2–4Merlin促进HCCLM3迁移（放大倍数：×200；比例尺，50 微米）。计算迁移细胞的数量（平均值±s.d。，n个=3），并显示在面板右侧*对<0.05; **对<0.01，基于学生的t吨-测试。(b条)在Merlin基因敲除的Huh-7和HCCLM3细胞中检测到EMT相关基因。(**c（c）**)在CSQT2细胞中检测到EMT相关基因。(d日)EMT相关基因在^重量Mer公司(^重量梅林）或^Δ2–4表达Merlin的HCCLM3细胞。(**e（电子）**)TGF-β治疗后梅林敲低的HCCLM3细胞中EMT相关基因表达的Western分析。(**（f）**)TGF-β诱导EMT相关基因的表达^重量梅林和^Δ2–4HCCLM3细胞中的梅林。(克)Western分析显示β-catenin和N-cadherin在^重量梅林，^Δ2–4梅林或^重量梅林/^Δ2–4Merlin用所示抗体瞬时转染HCCLM3细胞*对<0.05; **对<0.01，基于学生的t吨-测试。

**图5。梅林的沉默或^Δ2–4梅林促进茎的活动。**
(一)在无血清培养基的超低连接板中，shMerlin表达的Huh-7细胞比扰乱表达的Huh-7细胞形成更多更大的球体。测量了球体的数量和大小，并在每个面板下方显示。刻度条，100 μm。(b条)在Huh7-scrambled和Huh7-shMerlin细胞中检测到EMT相关基因。(**c（c）**)在shMerlin表达和打乱表达的CSQT2中测量球体的数量和大小。梅林基因的敲除增加了Huh-7细胞中球体的数量。刻度条，100 μm。(d日)在CSQT2打乱细胞和CSQT2-shMer细胞中检测到EMT相关基因的表达。(**e（电子）**)两者都有^Δ2–4与对照组相比，Mer I型和II型促进HCCLM3细胞球形的形成^重量Mer-expression细胞。刻度条，100 μm。(**（f）**)在^重量Mer表达和^Δ2–4Mer-expressing HCCLM3细胞。上述分析在一–**（f）**分别重复三次。平均值表示为平均值±标准差。本图中的统计分析均基于学生的t吨-测试*对<005; **对<0.01; ***对<0.001。(克)空载体中侧群细胞的比例，^重量梅林，和^Δ2–4表达Merlin的HCCLM3细胞。(小时)侧群细胞在打乱和shMerlin表达的CSQT2细胞中的比例。

**图6。^Δ2–4Merlin失去了锚定膜和与ERM和β-catenin结合的功能。**
(一)Myc-tagged公司^重量Mer或Myc-tagged^Δ2–4Mer在HCCLM3细胞中表达，并用抗Myc抗体进行免疫荧光染色。（比例尺，20 微米）。(b条)表达shMerlin的HCCLM3细胞中β-catenin的免疫荧光分析。DAPI用于核染色。比例尺，20 微米；小正方形放大倍数：×400）(**c（c）**)共聚焦分析^重量梅尔和^Δ2-4HCCLM3细胞中的Mer。Myc-tagged公司^重量Mer或myc-tagged^Δ2-4Mer在HCCLM3细胞中表达。用β-catenin或Myc-tag抗体对细胞进行染色。细胞核用DAPI染色。（比例尺，20 微米；小正方形放大倍数：×400）。(d日)免疫沉淀法^重量Mer或^Δ2–4与ERM和β-catenin合并。(**e（电子）**)分馏^重量梅尔和^Δ2–4对表达Mer的HCCLM3细胞进行检测，并用免疫印迹法分析所示抗体的β-catenin表达。(**（f）**)^Δ2-4Mer-或^重量将表达Mer的HCCLM3细胞注射到BALB/C裸鼠的尾静脉。肺转移瘤用H&E染色；比例尺，100 μm。计算肿瘤数量并显示在图表右侧（每组五只小鼠）*对<0.05; **对<0.01，基于学生的t吨-测试。

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