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.2015年10月1日;10(10):e0139153。
doi:10.1371/journal.pone.0139153。 电子收集2015。

化学固定过程中宿主细胞物质向沙眼衣原体包涵体内腔的差异移位

附属公司

化学固定过程中宿主细胞物质在沙眼衣原体包涵体腔内的差异易位

马塞拉·科克斯等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

沙眼衣原体控制宿主细胞途径以确保其增殖和存活。宿主物质转移到致病性液泡(称为“包涵体”)可能有助于营养物质的获取,包涵体内观察到各种细胞器,包括脂滴、过氧化物酶体、多泡体成分和内质网膜。然而,在活细胞中,这些过程很少被记录下来。在这里,我们调查了大量亚细胞元素的定位,发现ER、线粒体和包涵膜位于固定细胞的包涵腔内。然而,我们很少看到活内含物中这些细胞器在腔内定位的证据。使用延时视频显微镜,我们记录了化学固定过程中ER标记物移位到包涵体腔中的情况。这些包埋内ER元件可抵抗各种固定后操作,并可通过免疫荧光显微镜进行检测。我们推测,细胞器子集的定位可能在固定过程中被夸大。最后,我们在贝氏柯克斯体感染细胞的致病液泡中发现了类似的结构,这表明固定诱导的细胞物质移位可能发生在一系列细胞内病原体的液泡中。

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图1
图1。线粒体、ER和包涵膜位于C类.沙眼衣原体夹杂物。
HeLa细胞被感染C类.沙眼衣原体LGV L2,转染指示质粒,固定在30 hpi进行连续旋转圆盘激光共焦分析。注意内质网、线粒体基质和外膜以及包涵体管腔内包涵体膜的标记(A,青箭头)。图像描绘了夹杂物中心的单个z截面,夹杂物被视觉识别为大的黑色中心椭圆或用虚线勾勒。细胞定位标记出现饱和,因为内含物内的物质通常明显较暗。(B) 评估每个内含物的整个3D空间内内化结构的频率。质粒分为内质网、线粒体、包涵体、胞浆、再循环内体或其他标记物。在另一类中,GFP-GalT定位于高尔基体,CD63-GFP定位于MVB,LAMP1-GFP定位于溶酶体,KPhi-mRFP定位于质膜。50%处的虚线区分包裹体内腔内结构的高频和低频。每个实验中评估了12–20个夹杂物,显示了三个独立实验的平均值±SEM。比例尺代表5μm。
图2
图2。ER标记显示固定而非活细胞包涵体管腔内的扩张结构。
HeLa细胞被感染C类.沙眼衣原体与ER-RFP(红色)和Sec61β-GFP(绿色)联合转染的LGV L2在30 hpi时被固定或在活着时进行三维成像。用激光扫描共聚焦显微镜采集图像。(A) 朝向细胞中心的单个xy显微照片。有关沿z轴的xy显微照片的进展,请参见S1和S2电影。(B) 图像用于在3D中渲染体积。固定单元格的3D渲染在z轴上受到限制,以允许在包含范围内进行查看。请参阅S3–S6电影中的QuickTime虚拟现实文件,以旋转和查看这些3D卷。注意,在固定细胞的包涵体管腔内存在膨胀的材料网络。N表示原子核。比例尺代表5μm。
图3
图3。ER-RFP在化学固定过程中移位到包涵体腔。
HeLa细胞被感染C类.沙眼衣原体LGV L2并用ER-RFP转染。在30 hpi时,将活细胞置于4%多聚甲醛中,并用激光扫描共聚焦显微镜随时间成像。注意在固定过程中ER-RFP气泡进入内含物管腔的成因(青色箭头)。请参阅S7 Movie以获取延时视频,该视频在更大的视野中包含更多单元格。N表示原子核。比例尺代表10μm。
图4
图4。在甲醛和醇基化学固定后,通过免疫荧光显微镜检测包涵体内的ER结构。
HeLa细胞被感染C类.沙眼衣原体LGV L2。(A) 用ER-RFP转染感染细胞,用不同浓度的多聚甲醛(PFA)或甲醛(Form)固定在30 hpi,并评估内含物内ER-RFP的频率。(B和C)感染细胞转染ER-RFP,如图所示。在30 hpi时,用PFA、甲醇或乙醇固定细胞,然后用Triton X-100(Tx100)渗透,如图所示。用ER蛋白PDI抗体对处理后的细胞进行免疫荧光处理,并评估内含物内PDI阳性结构的频率。比例尺代表5μm。
图5
图5。致病液泡内的ER-RFP贝氏柯克斯体.
HeLa细胞被感染贝氏柯克斯体转染ER-RFP,固定于52 hpi。注意,致病性液泡(青色箭头)内腔中存在ER-RFP结构,类似于沙眼衣原体夹杂物。N表示细胞核,虚线表示放大倍数较高的区域。比例尺代表5μm。

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引用人

工具书类

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