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.2015年12月;19(12):2851-64.
doi:10.1111/jcmm.12678。 Epub 2015年9月28日。

环(苯丙氨酸-脯氨酸)通过活性氧诱导哺乳动物细胞DNA损伤

附属公司

环(苯丙氨酸-脯氨酸)通过活性氧诱导哺乳动物细胞DNA损伤

Kwanghyun Lee(李光铉)等。 细胞与分子医学杂志. 2015年12月.

摘要

环(苯丙氨酸-脯氨酸)是由动物、植物、细菌和真菌等多种生物产生的。它具有多种生物功能,包括抗真菌活性、抗菌活性和分子信号。然而,一些研究已经证明了环(苯丙氨酸-脯氨酸)对哺乳动物细胞过程的影响,如细胞生长和凋亡。在本研究中,我们研究了环(苯丙氨酸-脯氨酸)是否影响哺乳动物细胞中与DNA损伤相关的细胞反应。我们发现,1 mM环(苯丙氨酸-脯氨酸)处理通过ATM-CHK2激活以及DNA双链断裂诱导H2AX(S139)磷酸化。基因表达分析表明,环(苯丙氨酸-脯氨酸)处理抑制了与活性氧(ROS)清除和生成调节相关的基因子集。我们还发现,环(苯丙氨酸-脯氨酸)处理会引起线粒体膜的扰动,导致ROS,尤其是超氧化物的生成增加。总之,我们的研究表明,环(苯丙氨酸-脯氨酸)治疗通过提高哺乳动物细胞中的ROS诱导DNA损伤。我们的发现可能有助于解释细菌感染诱导宿主哺乳动物细胞DNA损伤反应激活的机制。

关键词:DNA损伤;彗星实验;环二肽;环(苯丙氨酸-脯氨酸);活性氧物种。

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图1
图1
诱导DNA中的损坏cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。(A类)典型图像显示γH2增加斧头病灶形成cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。相比之下,1 mM线性FP公司二肽(FP公司)治疗或不治疗(CTR公司)不会诱发γH2斧头病灶形成。之后国际的‐用1 mM培养407个细胞cFP公司在指定的时间内,用抗磷酸H2对细胞进行免疫染色斧头(S139)抗体。Nuclei使用DAPI公司染色。作为阳性对照,国际的‐用1μM阿霉素(Doxo)处理407个细胞;比例尺,10μm。(B类)H2的磷酸化斧头(S139)增加cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。然而,1 mM线性处理FP公司二肽(FP公司)不会诱发H2斧头(S139)磷酸化。作为阳性对照,国际的‐用1μM阿霉素(Doxo)处理407个细胞。用抗磷酸H2对裂解产物进行免疫印迹斧头(S139)抗体。抗‐β肌动蛋白抗体作为负荷对照。定量分析蛋白质印迹。相对谱带强度表示为平均值±标准差(C类)增加DNA中的损坏cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。用1 mM培养细胞后cFP公司或线性FP公司二肽(FP公司)48小时后,细胞被包埋、裂解并在琼脂糖中电泳。DNA使用彗星得分程序分析损伤。作为控制,国际的‐407个细胞未经处理(CTR公司)或用1μM阿霉素(Doxo)治疗***P(P)≤ 0.005.
图2
图2
激活DNA损伤响应cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。(A类)CHK(检查)2(T68)和自动取款机(S1981)在cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。用1 mM培养细胞后cFP公司或线性FP公司二肽(FP公司)48小时后,用抗磷免疫印迹法对裂解产物进行免疫印迹自动标签阅读器(S428),抗磷酸自动取款机(S1981)和抗磷CHK(检查)2(T68)抗体。作为控制,国际的‐407个细胞未经处理(CTR公司)或用1μM阿霉素(Doxo)治疗。定量分析蛋白质印迹。(B类C类)典型图像显示磷酸化H2的共定位斧头(S139),磷酸化自动取款机(S1981)和53英国石油公司1英寸cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。用1 mM处理的细胞cFP公司或线性FP公司二肽(FP公司)48小时内用抗磷酸H2进行联合免疫染色斧头(S139),抗磷自动取款机(S1981)和抗-53英国石油公司1种抗体组合。作为控制,国际的‐407个细胞未经处理(CTR公司)或用1μM阿霉素(Doxo)治疗;比例尺,10μm*P(P)≤0.05和**P(P)≤ 0.01.
图3
图3
自动取款机调解DNA中的损坏碳纤维蛋白‐经过处理国际的‐407个电池。(A类)的文字记录自动取款机被有效耗尽自动取款机核糖核酸.的表达式自动取款机由实时确定聚合酶链反应控制(siCTR公司)或自动取款机核糖核酸(si自动取款机). (B类)典型图像表明自动取款机降低γH2斧头病灶形成cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。控制后或自动取款机核糖核酸转染后,用1 mM培养细胞cFP公司48小时,用抗磷H2进行免疫染色斧头(S139)抗体。未经处理的细胞(CTR公司)作为阴性对照;比例尺,10μm。(C类)耗尽自动取款机降低H2的磷酸化斧头(S139)英寸cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。si之后核糖核酸转染后,用1 mM培养细胞cFP公司48小时后,用抗磷H2对裂解产物进行免疫印迹斧头(S139)抗体。作为控制,国际的‐407个细胞未经处理(CTR公司)或用1μM阿霉素(Doxo)治疗。定量分析蛋白质印迹。(D类)典型图像表明自动取款机是必需的cFP公司诱导的γH2斧头病灶形成。用1 mM培养细胞后碳纤维蛋白与10μM配合使用自动取款机抑制剂(库克大学‐55933)或二甲基亚砜48小时后,用抗磷酸H2对细胞进行免疫染色斧头(S139)抗体。未经处理的细胞(CTR公司)作为阴性对照;比例尺,10μm。(E类)用1 mM培养细胞后cFP公司与10μM配合使用自动取款机抑制剂(库克大学‐55933)或二甲基亚砜48小时后,用抗磷酸H2对裂解产物进行免疫印迹斧头(S139)抗体。作为控制,国际的‐407个细胞未经处理(CTR公司)或用1μM阿霉素(Doxo)治疗。定量分析蛋白质印迹*P(P)≤ 0.05, **P(P)≤0.01和***P(P)≤ 0.005.
图4
图4
相关基因的表达ROS公司清除和生产cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。之后国际的‐用1 mM培养407个细胞cFP公司在48小时内,通过实时测定基因表达聚合酶链反应。通过比较未治疗组和未治疗组的基因表达来确定相对表达(CTR公司)和1毫微米碳纤维蛋白‐经过处理国际的‐407个电池。第份成绩单GAPDH公司用作对照*P(P)≤ 0.05, **P(P)≤0.01和***P(P)≤ 0.005.
图5
图5
ROS公司依赖DNA中的损坏cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池(A类)的级别ROS公司升高了1 mMcFP公司中的处理国际的‐407个电池。然而,1 mM线性FP公司二肽(FP公司)治疗不会提高ROS公司用1 mM培养细胞后cFP公司结合0.5 mMN个‐乙酰半胱氨酸(NAC公司)或H2O持续48小时,ROS公司通过流式细胞术测定水平DCFDA公司.未处理的细胞(CTR公司)用作阴性对照。(B类)ROS公司清除剂处理减少cFP公司诱导的磷酸化CHK(检查)2(T68)和自动取款机(第1981条)。用抗磷酸免疫印迹法对裂解产物进行免疫印迹CHK(检查)2(T68)和抗磷自动取款机(S1981)抗体。作为控制,国际的‐407个细胞未经处理(CTR公司)或用1μM阿霉素(Doxo)治疗。定量分析蛋白质印迹。(C类)代表性图片表明ROS公司清除剂处理减少cFP公司诱导γH2斧头病灶形成。用1 mM培养细胞后cFP公司结合0.5 mMNAC公司或H2O持续48小时,用抗磷酸H2对细胞进行免疫染色斧头(S139)抗体。未经处理的细胞(CTR公司)作为阴性对照;比例尺,10μm。(D类)ROS公司清除剂处理减弱cFP公司诱导的DNA损坏。用1 mM培养细胞后cFP公司结合0.5 mMNAC公司或H2O持续48小时,进行中性彗星试验。未经处理的细胞(CTR公司)作为阴性对照。(E类)细胞色素C释放增加cFP公司‐经过处理国际的‐407个细胞。1 mM的细胞质部分cFP公司或线性FP公司二肽处理国际的如材料和方法一节所述,使用抗细胞色素C抗体对407细胞进行免疫印迹。未经处理的细胞(CTR公司)作为阴性对照。定量分析蛋白质印迹。(F类)线粒体膜受到干扰cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。之后国际的‐用1 mM处理407个细胞cFP公司或线性FP公司二肽48小时后,用5μM罗丹明123对细胞进行染色,并进行流式细胞术。未处理细胞(CTR)作为阴性对照*P(P)≤ 0.05, **P(P)≤0.01和***P(P)≤ 0.005.
图6
图6
的移除cFP公司恢复DNA损坏修复国际的‐407个电池。之后国际的‐用1 mM培养407个细胞cFP公司在48小时内,用新培养基更换细胞培养基cFP公司并培养指定时间。(A类)冲洗cFP公司衰减ROS公司生产cFP公司处理过的国际的‐407个电池。ROS公司用流式细胞仪测定其含量。未处理的细胞(CTR公司)作为阴性对照。(B类)代表性图片表明cFP公司降低γH2斧头病灶形成cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。用抗磷酸H2对细胞进行免疫染色斧头(S139)抗体。未经处理的细胞(CTR公司)作为阴性对照;比例尺,10μm。(C类)冲刷cFP公司减少H2斧头(S139)磷酸化cFP公司‐经过处理国际的‐407个电池。用抗磷酸H2对裂解产物进行免疫印迹斧头(S139)抗体。作为控制,国际的‐407个细胞未经处理(CTR公司)或用1μM阿霉素(Doxo)治疗。定量分析蛋白质印迹。相对带强度表示为平均值±S.D(D类)冲刷cFP公司衰减DNA中的损坏cFP公司‐经过处理国际的‐407个细胞。清洗后进行中性彗星试验。未经处理的细胞(CTR公司)用作阴性对照。(E类)提出的模型。cFP公司治疗诱导与ROS公司生产/清除和增加ROS公司线粒体中(超氧化物)的产生。这一事件可能会维持ROS公司(超氧化物),导致DNA损坏,例如DSB公司. *P(P)≤ 0.005.

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