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.2016年1月；63(1):173-84.
doi:10.1002/ep.28251。 Epub 2015年11月26日。

p62-Keap1-NRF2通路的激活对肝细胞癌细胞铁下垂的保护作用

孙晓芳 1, 战辉欧 1, 陈若禅 2, 小华牛 1, De Chen（德陈） 1, 瑞康 2, 道林堂 1 2
附属公司

p62-Keap1-NRF2通路的激活对肝细胞癌细胞铁下垂的保护作用

孙晓芳等。 肝病学. 2016年1月.

摘要

铁下垂是最近发现的一种由铁依赖性脂质活性氧累积引起的调节性细胞死亡。然而，调节脱铁性贫血的分子机制仍然不清楚。在这里，我们报道了核因子红细胞样2相关因子2（NRF2）在保护肝细胞癌（HCC）细胞免受铁下垂方面发挥着核心作用。暴露于铁凋亡诱导化合物（例如，橡皮素、索拉非尼和丁硫氨酸磺胺）后，p62表达阻止NRF2降解，并通过灭活Kelch-like ECH-associated protein 1增强随后的NRF2核积累。此外，核NRF2与转录共激活因子小v-maf禽肌肉筋膜纤维肉瘤癌基因同源蛋白如MafG相互作用，然后激活醌氧化还原酶-1、血红素加氧酶-1和铁蛋白重链-1的转录。RNA干扰对肝癌细胞p62、醌氧化还原酶-1、血红素加氧酶-1和铁蛋白重链-1的敲除促进了对橡皮素和索拉非尼的反应。此外，基因或药物抑制肝癌细胞中NRF2的表达/活性可提高体外和肿瘤异种移植模型中橡皮素和索拉非尼的抗癌活性。

结论：这些发现揭示了铁下垂的新分子机制和信号通路；NRF2的状态是决定肝癌细胞对铁凋亡靶向治疗反应的关键因素。

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数字

图1
图1。细胞凋亡过程中NRF2表达水平的增加
（A，B）用橡皮素（10μM）、牛血清白蛋白（200μM）和索拉非尼（5μM）处理显示的肝癌细胞，加或不加显示的抑制剂（ZVAD-FMK，10μM；铁抑素-1，1μM；坏死磺胺，0.5μM）24小时，并测定细胞活力（A）和MDA水平（B）（n=3，*p<0.05）。（C，D）用橡皮素（10μM）、BSO（200μM）和索拉非尼（5μM）处理指示的HCC细胞24小时，并测定NRF2蛋白（C）和mRNA（D）水平（n=3，*p<0.05）。（E） 用含有或不含环己酰亚胺（“CHX”，20μg/ml）或MG-132（5μM）的橡皮素（10μM）处理HepG2细胞24小时，并测定NRF2蛋白水平。（F） 用20μg/ml CHX处理HepG2细胞1小时（左），或用10μM erastin处理4小时，然后用20μg/ml CHX处理1小时。在指定的时间点对细胞进行裂解。用抗NRF2和抗肌动蛋白抗体对细胞裂解产物进行western blot分析。
图2
图2。p62和Keap1之间的相互作用调节铁凋亡过程中NRF2的表达水平
（A，B）用橡皮素（10μM）和索拉非尼（5μM）处理肝癌细胞24小时。使用蛋白质印迹和免疫沉淀（IP）分析Keap1和p62（A）的蛋白水平以及Keap1与p62（B）之间的相互作用（n=3，*p<0.05）。（C，D）用橡皮素（10μM）和索拉非尼（5μM）处理p62敲低肝癌细胞24小时。用western blot和IP检测NRF2、Keap1和p62（C）的蛋白水平，以及NRF2和Keap1（D）之间的相互作用。（E） shRNA对Keap1的敲除逆转了erastin（10μM）处理HepG2细胞后NRF2停止降解过程中p62的丢失。
图3
图3。NRF2表达有助于抗铁凋亡
（A） 显示NRF2敲低肝癌细胞中NRF2表达的Western blot分析。（B） 用橡皮素（1.25-10μM）和索拉非尼（1.25-100μM）处理指示的敲除HCC细胞24小时，并检测细胞活力（n=3，*p<0.05）。（C） 用橡皮素（10μM）和索拉非尼（5μM）处理指示的敲除HCC细胞24小时，并测定GSH、MDA和铁水平（n=3，*p<0.05）。（D） 用橡皮素（10μM）和索拉非尼（5μM。
图4
图4。NRF2激活有助于抗脱铁性贫血
（A–C）用橡皮素（10μM）和索拉非尼（5μM）处理肝癌细胞24小时。测定核提取物（A）中NRF2的表达、NRF2（B）的转录活性以及NRF2与MafG（C）之间的相互作用（n=3，*p<0.05）。（D） 用erastin（10μM）和索拉非尼（5μM）处理指示的NRF2敲低的HCC细胞24小时。Q-PCR检测NQO1、HO1和FTH1的mRNA表达（n=3，*p<0.05）。（E） 用橡皮素（10μM）和索拉非尼（5μM）治疗24小时后，特异性shRNA对NQO1、HO1和FTH1的敲除增强了指示HCC细胞的生长抑制（n=3，*p<0.05）。（F） NRF2抑制剂生物碱胡芦巴碱（0.5μM）在用橡皮素（10μM）和索拉非尼（5μM）治疗24小时后，抑制了NQO1、HO1和FTH1 mRNA的表达，并增强了对HCC细胞的生长抑制（n=3，*p<0.05）。
图5
图5。抑制NRF2增强铁凋亡体内
（A，B）NRF2敲低Hepa1-6细胞对橡皮素和索拉非尼更敏感体内（A）C57BL/6小鼠皮下注射指定的Hepa1-6细胞（1×106细胞/小鼠），并在第7天用橡皮素（30mg/kg i.p.，隔天两次）和索拉非尼（10mg/kg i.p.，隔日一次）治疗两周。每周计算肿瘤体积。数据表示平均值±SE（n=5-8只小鼠/组，*p<0.05）。（B） 第28天分离肿瘤中指示基因表达的Q-PCR分析。（C，D）胡卢巴碱增加了橡皮素和索拉非尼的抗癌活性体内（C）C57BL/6小鼠皮下注射指定的Hepa1-6细胞（1×106细胞/小鼠），并在第7天用橡皮素（30mg/kg i.p.，隔天两次）和索拉非尼（10mg/kg i.p.，隔日一次）处理，加或不加胡芦碱（1mg/kg i.p，隔天一次），持续两周。每周计算肿瘤体积。数据代表平均值±SE（n=5-8只小鼠/组，*p<0.05）。（D） 第28天分离肿瘤中指示基因表达的Q-PCR分析。
图6
图6
NRF2的激活可抵抗肝细胞癌细胞的铁下垂。
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