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.2015年12月1日；24(23):6565-79.
doi:10.1093/hmg/ddv345。 Epub 2015年9月22日。

抑制复合物和H3K9二甲基化在PRDM5相关性脆性角膜综合征中的作用

路易丝·波特 1, 乔治·G·加利 2, 萨利·威廉姆森 三, 朱利安·塞利 4, 大卫·奈特 4, 护士Elcioglu 5, 阿里·艾丁 6, 穆斯塔法·埃尔西奥卢 7, 汉卡·文塞拉 8, 安德斯·H·隆德 9, 理查德·邦谢克 10, 格雷姆C黑 11, 福布斯D Manson 三
附属机构

抑制复合物和H3K9二甲基化在PRDM5相关性脆性角膜综合征中的作用

路易丝·波特等。 人类分子遗传学. .

摘要

2型脆性角膜综合征（BCS2）是一种遗传性结缔组织病，具有破坏性的眼部表型，由含有5（PRDM5）的转录因子PR结构域的突变引起，该突变被假设通过组蛋白和DNA甲基化发挥表观遗传效应。在这里，我们研究了临床样本，包括BCS2患者的皮肤成纤维细胞和视网膜组织，以阐明PRDM5的表观遗传学作用及其在疾病中失调的机制。首先，我们使用免疫组织化学方法报告了两个BCS2近亲（PRDM5Δ外显子9-14）眼睛的视网膜血管形态异常，并从PRDM5突变p.Arg590*和Δ外显子9-14患者的皮肤成纤维细胞表达微阵列以及PRDM5 ChIP序列测定实验中获得数据。对失调PRDM5靶基因的基因本体分析揭示了支持血管完整性和发育的细胞外基质（ECM）基因的富集。Q-PCR和ChIP-qPCR证实患者成纤维细胞血管结构（COL13A1、COL15A1、NTN1、CDH5）中ECM稳定性的关键介质上调。我们在成纤维细胞中的这些PRDM5靶基因上鉴定出H3K9二甲基化（H3K9me2），并通过免疫共沉淀结合质谱法证明BCS2突变p.Arg83Cys减少了PRDM5与抑制复合物的相互作用，包括NuRD复合蛋白CHD4和抑制染色质相互作用物HP1BP3。我们通过免疫组织化学在两个缺乏外显子9-14的表亲的视网膜中观察到异染色质蛋白1结合蛋白3（HP1BP3）染色减少，并且通过蛋白质印迹在三个患者的皮肤成纤维细胞（p.Arg590*、p.Glu134*和Δ外显子9-14）中观察到H3K9me2失调。这些发现表明，PRDM5与抑制复合物的不良相互作用以及H3K9me2的失调在PRDM5相关疾病中起作用。

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数字

图1。
图1。
患者P4的临床特征和PRDM5的示意图。(A类)患者P4的临床特征（表1）是一名9岁的患者，其表型包括明显的角膜变薄，左眼和右眼的中心角膜厚度分别为350µm和380µm（正常范围为515–565µm），如图1和图2所示（角膜地形图）。也存在明显的不规则散光，如灰色方框中的K值所示（面板1和2）。（3） 受累儿童的照片显示出特征性巩膜。该患者存在BCS的眼外特征，包括蛛网膜下腔炎（4）、关节松弛，尤其是上肢大关节（5）和扁平足（6）。(B类)显示N端PR-SET域和16个锌指的PRDM5示意图。新突变p.Arg83Cys的位置显示为之前发布的突变p.Tyr107Cys、突变p.Glu134*、外显子9-14和p.Arg590*的内部缺失。
图2。
图2。
PRDM5相关疾病与两名患者的视网膜变薄和视网膜微血管异常有关。(A类)未受影响的对照组视网膜（#2，58岁，表1）和携带胶原蛋白的BCS患者P1和P2的H&E染色和IHC，检测胶原蛋白V、I和III（红色）和CD31（棕色）项目风险管理模型5突变Δ外显子9-14。H&E染色显示与对照组相比，P1中ONL和INL的视网膜细胞密度降低[物镜放大（OM）20×]。P2视网膜的H&E染色显示视网膜变性改变，INL和ONL的细胞核解剖结构紊乱。与对照样品（上排）相比，IHC显示BCS眼睛P1和P2的毛细血管染色（蓝色箭头）减少，胶原蛋白V、I和III以及CD31（中排和下排）的染色减少。视网膜小动脉和小静脉等较大血管的染色持续存在（黑色箭头）。对图像进行相同的记录和处理，以便在它们之间进行直接比较。(B类)P1、P2和对照视网膜#2中视网膜细胞计数（左侧面板）和视网膜毛细血管计数（右侧面板）的图形表示。左侧面板：视网膜INL和ONL中的平均视网膜细胞密度证实P2中视网膜INL中的细胞密度显著降低，P1中视网膜in和ONL的细胞密度均显著降低(P（P）< 0.01). 误差线表示平均值的95%置信区间。右图：P1和P2 BCS-2型视网膜中CD31的视网膜毛细血管染色减少具有统计学意义[P（P）< 0.01 (*)].
图3。
图3。
项目风险管理模型5突变导致许多在血管生物学中起作用的ECM相关基因上调，H3K9me2富含PRDM5结合的血管生成相关基因。(A类)BCS患者P2和P3皮肤成纤维细胞PRDM5靶基因的qPCR分析COL13A1系列,NTN1型,COL15A1系列和CDH5型mRNA水平标准化为GAPDH公司Y轴以对数标度（log2）表示基因表达的折叠变化。X轴显示评估的目标。FC1=P2皮肤成纤维细胞和年龄匹配的对照成纤维细胞107 mRNA表达的倍数变化（表1）。FC2=P3皮肤成纤维细胞与对照成纤维细胞L10 mRNA表达的倍数变化（表1）。误差条表示平均值周围的95%置信区间。成绩单等级COL13A1系列,NTN1型,COL15A1系列和CDH5型相对于对照，在BCS 2型突变细胞系中上调，对平均ΔCt值进行配对双尾t检验，达到统计学显著性(P（P）<0.01）。(B类)在P2成纤维细胞上调血管生物学作用的ECM相关基因子集中，对PRDM5和H3K9me1/2进行ChIP-qPCR，项目风险管理模型5Δ9–14; 和P3，项目风险管理模型5p.Arg590*（表1）。IgG用作阴性对照，数值表示为与输入相比的浓缩百分比。PRDM5结合的血管生成相关基因中存在H3K9 me1/2的富集COL13A1系列,COL15A1系列和NTN1型.
图4。
图4。
PRDM5与NuRD复合组分和HP1BP3相关。(A类)HA标记的WT PRDM5与特定内源性HEK293细胞蛋白对一些NuRD复合蛋白（MTA1、MTA2、CHD4）和HP1BP3的协同免疫沉淀实验。(B类)Ponceau-S染色显示蛋白质样本的装载量相等。
图5。
图5。
两名BCS患者的视网膜中HP1BP3表达降低。HP1BP3的免疫组织化学。(A类1和2）。对照眼（#2）外周（1）和中央视网膜（2）的HP1BP3染色，显示INL和ONL（OM 20×）的HP1 BP3核染色。（A3）。高倍镜下对照视网膜HP1BP3染色（OM 40×）。P2外周（4）和中央（5）视网膜（A4和5）HP1BP3染色项目风险管理模型5Δ外显子9-14（OM 20×）和高倍镜下P2外周视网膜（OM 40×）（A6)（A7和8）。P1外周（4）和中央（5）视网膜HP1BP3染色项目风险管理模型5Δ外显子9-14（OM 20×）和P1外周视网膜在更高放大倍数下（OM 40×）（A9）。对图像进行相同的记录和处理，以便在它们之间进行直接比较。(B类)P1和P2与对照样品（#2）在INL和ONL中HP1BP3阳性核百分比的图示。数值表示为八个盲细胞计数的平均值。误差线表示平均值的95%置信区间。结果显示HP1BP3染色显著减少（*）(P（P）<0.01）在P2的INL中(P（P）=0.006），ONL中P1和P2的HP1BP3染色显著减少(P（P）=0.001，对于P1和P（P）=0.006（P2）。
图6。
图6。
BCS2患者成纤维细胞中H3K9me2减少。不同浓度BCS患者成纤维细胞核提取物的免疫印迹项目风险管理模型5突变和未受影响的对照样品（4120）：H3K9me2；GAPDH和总组蛋白H3（负荷对照）。第5页；p.Glu134*；P3；p.Arg590*；第1页；Δ外显子9-14；4：对照样品（4120，表1）。Lanes在同一凝胶上跑步，但不接触。
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