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.2015年11月；21(11):1966-79.
doi:10.1261/rna.053629.115。 Epub 2015年9月21日。

加工和功能RNY5 RNA的胞外囊泡介导转移

Sudipto K Chakrabortty公司 1, 阿什温·普拉卡什 1, 加尔·内库什坦 1, 斯蒂芬·赫恩 1, 托马斯·金戈拉斯 1
附属公司

加工和功能RNY5 RNA的胞外囊泡介导转移

Sudipto K查克拉博蒂等。 核糖核酸. 2015年11月.

摘要

细胞外小泡（EV）被认为是促进细胞间通讯的一种手段。我们表明，当人类原代细胞暴露于癌细胞EV时，可以观察到原代细胞的快速死亡，而用原代或癌细胞EVs治疗的癌细胞则不显示这种反应。触发细胞死亡的活性因子是极有可能在EV内形成的人类RNY5基因83-nt一级转录物的29-31-核苷酸（nt）或22-23-nt处理片段。用癌细胞EV、来自原代或癌细胞EVs的脱蛋白总RNA或合成版本的31-nt和23-nt片段处理的原代细胞以剂量依赖性方式触发细胞快速死亡。通过EV转移处理过的RNY5片段可能反映了癌细胞为其增殖和侵袭建立有利微环境的一种新策略。

关键词：RNY5；肿瘤微环境；外泌体；细胞外小泡。

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数字

图1。
图1。
细胞外囊泡（EVs）纯化的验证。(A类)阴性染色后K562 EV的透射电镜图像显示，典型的杯状囊泡平均小于200 nm。(B类)纯化EVs的免疫电镜图像，标记有抗CD81（小鼠单克隆抗体），并用山羊抗小鼠IgG二级偶联5 nm金检测。图像上的黑点是与IgG二级抗体结合的电子致密金元素。(C类)未经处理EV的生物分析仪RNA图谱（RNA Pico-chip）（红色）、经RNase处理的EV的RNA图谱（绿色）和经洗涤剂和RNase（蓝色）处理的EVs的RNA图谱。(X（X）-轴）核苷酸长度；(年-轴）荧光装置。(D类)K562 EVs和全细胞蛋白质的Western blot分析。检测所选的蛋白质之前被鉴定为在EV或整个细胞中富集。（EV富集）ALIX(PDCD6IP系列基因），CD71(转铁蛋白受体1基因），TSG101(TSG101型基因）。（全细胞）PDI(交车前检查基因），纤维蛋白(FBL公司基因），抑制素(菲律宾比索基因）。
图2。
图2。
代表BJ全细胞内RNA家族相对丰度的饼图(A类)，K562全细胞(B类)、BJ EV(C类)和K562 EV(D类). 饼图中标记为“其他”的组代表了从多个基因编码注释类别（如假基因、反义内含子、线粒体t-RNA、穹窿RNA、免疫球蛋白基因等）获得的读数。
图3。
图3。
RNY5的碎片模式。(A类)全长RNY5结构。根据van Gelder等人（1994年）的数据，使用Mfold绘制了该结构。粗体线表示5′31-nt加工产品，突出显示8-nt图案。(B类)图中描绘了人类RNY5基因读取映射的最频繁（>1000次/百万）开始和停止位置。最常见的开始位置标记为RNY5注释的5′开始位置和注释的52位。最常见的停止位置是从RNY5基因的5′端开始的读取的23、29和31，以及从52开始读取的位置83，以及从位置1开始的一些读取。(C类)从K562、BJ细胞和EV纯化的RNY5 RNA的Northern blot。Y5加工产品的合成版本被用作尺寸标记。用与5′31-nt加工产物互补的探针检测RNA。（w） 全细胞RNA，（e）EV RNA(D类,E类)RNY5的体外加工。合成全长RNY5与0、2、4或8µg K562全细胞在37°下孵育30分钟(D类)或电动汽车(E类)蛋白质提取物。仅含有提取物且处理相同的样品用于控制蛋白质提取物中Y5 RNA的存在。检测按中所述进行C类注意，23nt和31nt大小的标记不是等摩尔的。(F类)Y5 5′31-mer变体的体外加工。Y5 5′31-mer的野生型（WT）、扰乱型（scram.）和8-nt模体扰乱型（motif scram。
图4。
图4。
流式细胞术定量细胞死亡。YO-PRO-1和Hoechst33342染料用于量化细胞死亡。Y（Y）-axis表示YO-PRO-1和Hoechst33342双阳性细胞所指示的细胞死亡百分比。重复数据的平均值用误差条表示，表示与平均值的差异。(A类)用EVs和EV RNA处理K562细胞时的细胞死亡水平。Y（Y）-轴表示观察到的细胞死亡百分比。提供了以下治疗方法：（蓝色）未经治疗：未经任何治疗的K562细胞；（绿色）K562 EV处理：K562细胞与K562 EV孵育；（红色）模拟：K562细胞仅用脂质体处理（无RNA）；（紫色）K562 EV RNA处理的K562细胞：；（绿松石色）完全超临界31-mer:k562细胞经31-nt加扰序列处理。(B类)用EVs和EV RNA处理BJ细胞时的细胞死亡水平。Y（Y）-轴表示观察到的细胞死亡百分比。提供了以下处理：（蓝色）未经处理：未经任何处理的BJ细胞；（红色）模拟：仅用脂质体处理的BJ细胞（无RNA）；（绿色）BJ-EV RNA：转染BJ-EVRNA的BJ细胞；（紫色）K562 EV RNA:K562 EV RNA处理的BJ细胞；（浅绿色）BJ EV：与BJ EVs孵育的BJ细胞；（绿松石）HeLa EV：与HeLa EVs孵育的BJ细胞；（橙色）U2-Os EV:BJ细胞与U2-Os-EV孵育；（淡蓝色）MCF7 EV:BJ细胞与MCF7 EVs孵育；（淡紫色）K562 EV：与K562 EV孵育的BJ细胞。(C类)RNY5 31-mer诱导细胞死亡表型的普遍性。横线表示每种细胞类型的细胞死亡净增加与模拟治疗的细胞死亡水平标准化。四种癌细胞系，包括（蓝色）K562（慢性粒细胞白血病）；（紫色）HeLa（宫颈腺癌）；（红色）MCF7（乳腺癌）；（绿色）U2-O（骨肉瘤）和四个原代细胞，包括（淡紫色）BJ（正常皮肤成纤维细胞）；（绿松石）HUVEC（正常人脐静脉内皮细胞）；（浅蓝色）IMR90（正常人肺成纤维细胞）；和（橙色）HFFF（正常人胎儿包皮成纤维细胞）转染RNY5 31-mer。每次转染均使用100个微粒体RNY5，但（橙色）HFFF除外，其中使用200 pmol RNY5 31-mer。(D类)RNY5 31mer在BJ细胞中诱导细胞死亡表型的剂量反应曲线。当BJ细胞被递增剂量（10、50、100、200、300和400 pmol）的RNY5 31-mer或非特异性RNA处理时，条形代表细胞死亡的百分比。AllStars阴性对照RNA（Qiagen）被用作非特异性核糖核酸对照。还显示了未处理或模拟处理（仅限脂多糖）BJ细胞的细胞死亡水平。(E类)100 pmol合成RNA寡核苷酸转染BJ细胞的细胞死亡水平。Y（Y）-轴表示细胞死亡百分比。用于转染的合成RNA寡核苷酸如下：（蓝色）未经处理：未经任何处理的BJ细胞；（黄色）模拟：BJ细胞仅用脂质体处理（无RNA）；（绿色）非特异性RNA：非特异性RNA控制（AllStars阴性对照siRNA）；（紫色）8-nt基序缺失：RNY5序列，核苷酸14-21基序缺失；（绿松石色）RNY5 31-mer补体：31-nt RNY5 3′侧片段；（浅橙色）8-nt基序打乱：RNY5 31-mer序列，核苷酸14-21打乱；（蓝色）RNY5 31mer加扰：31nt完全加扰序列；（橙色）DS RNY5 31-mer，双绞线RNY5 31-mer双工；（绿色）全长RNY5:RNY5 83聚体全长序列；（浅绿色）RNY5 31-mer：5′RNY5 31-nt片段；（浅紫色）RNY5 23-mer：5′侧RNY5 23-nt片段。(F类)从100 pmol合成RNA寡核苷酸转染K562细胞中观察到的细胞死亡水平。Y（Y）-轴表示细胞死亡百分比。用于转染的合成RNA寡核苷酸如下：（蓝色）未经处理：未经任何处理的K562细胞；（黄色）模拟：K562细胞仅用脂质体处理（无RNA）；（绿色）非特异性RNA：非特异性RNA控制（AllStars阴性对照siRNA）；（紫色）8-nt基序缺失：RNY5序列，核苷酸14-21基序缺失；（橙色）8-nt基序打乱：RNY5 31-mer序列，核苷酸14-21打乱；（蓝色）RNY5 31-mer紧急停堆：31-nt完全加扰序列；（红色）DS RNY5：双绞线；（绿色）全长RNY5 83米；（浅绿色）RNY5 31-mer：5′RNY5 31-nt片段。
图5。
图5。
TGF-β途径的一部分由KEGG途径描述，我们在这两种处理（K562 EV和32-nt合成RNA）的BJ和HUVEC细胞中观察到基因转录水平的类似变化。该途径强调了该途径这一部分中大多数基因转录水平的共同反应。
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