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.2015年9月16日；4（9）：e002384。
doi:10.1161/JAHA.115.002384。

血管平滑肌Sirtuin-1在血管紧张素Ⅱ诱导的高血压中对主动脉夹层的保护作用

杰西卡·L·弗莱 1, Yasunaga Shiraishi先生 1, 拉斐尔·图尔科特 2, 于迅捷 三, 袁志高 4, 拉希德·阿基基 1, 马库斯·巴赫施米德 1, 张燕航（Yanhang Zhang） 5, 凯萨琳·G·摩根 6, 理查德·科恩 1, 弗朗西斯卡·塞塔 1
附属公司

血管平滑肌Sirtuin-1在血管紧张素Ⅱ诱导的高血压中对主动脉夹层的保护作用

杰西卡·L·弗莱等。 J Am心脏协会. .

摘要

背景：Sirtuin-1（SirT1）是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（+）的脱乙酰酶，是细胞对代谢、炎症和氧化应激反应的关键酶；然而，内源性SirT1在血管系统中的作用尚未完全阐明。我们的目标是评估血管平滑肌SirT1在主动脉壁对血管紧张素II（一种强有力的肥厚、氧化剂和炎症刺激物）的生理反应中的作用。

方法和结果：血管平滑肌中缺少SirT1的小鼠（即平滑肌SirT1-基因敲除）在输注血管紧张素II（1 mg/kg/天）后，因主动脉夹层导致的死亡率极高（70%），但在等量的去甲肾上腺素后，尽管血压升高相当。与野生型同窝小鼠相比，平滑肌SirT1基因敲除小鼠没有表现出任何异常的主动脉形态或血压。尽管如此，与血管紧张素Ⅱ治疗的野生型小鼠相比，平滑肌SirT1基因敲除小鼠的主动脉弹性板层严重紊乱，弹性蛋白断裂频繁，氧化剂生成增加，主动脉僵硬。血管紧张素Ⅱ处理的平滑肌SirT1基因敲除小鼠主动脉中基质金属蛋白酶的表达和活性增加，而血管平滑肌中SirT过度表达的小鼠或使用氧化剂清除剂tempol可阻止基质金属蛋白酶表达和活性的增加。

结论：主动脉平滑肌中的内源性SirT1需要通过抑制氧化剂诱导的基质金属蛋白酶活性来维持主动脉壁的结构完整性，以应对氧化剂和炎症刺激，至少部分如此。SirT1激活剂可能是一种新的治疗方法，用于预防高危患者的主动脉夹层和破裂，如患有高血压或遗传疾病（如马凡综合征）的患者。

关键词：血管紧张素Ⅱ；主动脉夹层；sirtuin‐1；血管平滑肌。

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数字

图1
图1
血管平滑肌SirT1缺失的新型小鼠菌株（SMKO）。A、 经qRT-PCR证实的主动脉（n=5，WT，n=5；SMKO）和培养的VSM细胞（n=3）上VSM SirT1外显子4的特异性基因缺失。SirT1 mRNA表达归一化为β-肌动蛋白，并表达为与WT的折叠变化*P（P）<0.05 vs WT.B，WT和外显子4的代表性Western blot−/−WT小鼠（n=4）和SMKO小鼠（n=4）主动脉中的SirT1。每条通道代表1只鼠标。AngII表示血管紧张素II；外显子；定量逆转录聚合酶链反应；SirT1，sirtuin-1；SMKO，平滑肌SirT1基因敲除；血管平滑肌；血管平滑肌细胞；野生型野生型。
图2
图2
VSM中的特异性Cre重组酶表达。番茄报告鼠组织的代表性图片。A、 自上而下：SM22α-Cre的主动脉（×10）、肾小动脉和肠系膜小动脉（×20）中的绿色（EGFP-Tomato）和红色（red-Tomata）荧光−（左）和SM22α-Cre+（右）老鼠。B、 在主动脉的VSM（顶部放大，×40）和指定组织的动脉中实现了特异性Cre重组表达，但在其实质中没有实现（×4）。红色荧光信号表示Cre−细胞和绿色荧光表明Cre+细胞。EGFP表明绿色荧光蛋白增强；SM22α，平滑肌22α蛋白；血管平滑肌；野生型野生型。
图3
图3
SMKO中SirT1缺失对主动脉中膜是特异性的。A、 WT和外显子4的代表性Western blot−/−WT和SMKO（KO）小鼠主动脉中膜和外膜中的SirT1。外膜也不表达缺失的变异体（外显子4−/−SirT1）或AngII前后的平滑肌标志物SM22α。每条通道代表1只鼠标。每个实验组n=4。B、 超声心动图测量轻度麻醉的WT（n=4）和SMKO小鼠（n=5）的EF和FS百分比，以及盐水和AngII处理的WT和SMKO小鼠（每组n=4个）的HW/TL（mg/mm）*P（P）<0.05 vs生理盐水。C、 WT和SMKO VSM细胞匀浆中含有抗乙酰赖氨酸抗体的乙酰化p53的三重Western blot的代表性图像，表明SirT1活性。10%输入，无IP全细胞裂解。AngII表示血管紧张素II；EF，射血分数；Ex，外显子；FS，分数缩短；HW/TL，心脏重量/胫骨长度比；IP，免疫沉淀；K、 赖氨酸；KO，平滑肌SirT1击倒；SirT1，sirtuin-1；SM22α，平滑肌22α蛋白；野生型野生型。
图4
图4
作为对AngII的反应，SMKO小鼠死于主动脉夹层。A、 WT和SMKO（KO）小鼠在14天AngII输注过程中的存活曲线。括号中显示的小鼠数量*P（P）<0.05 vs WT.B，生理盐水和AngII处理的WT和SMKO（KO）小鼠主动脉的代表性图片。经AngII处理的SMKO小鼠主动脉剥离明显。箭头表示主动脉壁撕裂点。C，从纵轴观察AngII治疗的SMKO小鼠主动脉剥离的代表性图片。真假主动脉腔用虚线突出显示（左）。主动脉切片上的Masson三色染色证实假腔充满血液（×4，右）。AngII表示血管紧张素II；KO，平滑肌sirtuin-1基因敲除；野生型野生型。
图5
图5
WT和SMKO小鼠的血管收缩反应。在AngII输注前（基线）和输注5天（D1至D5）期间（每天1毫克/千克），用无线遥测仪测量清醒WT和SMKO小鼠的血压（A）和心率（B）。每组n=5*P（P）<0.05 vs WT。生理盐水和AngII处理的WT和SMKO小鼠主动脉（C）和肠系膜（D）动脉mRNA提取物的定量RT-PCR（n=7，WT/生理盐水；n=8，SMKO/生理盐水，n=9，WT/AngII；n=9 SMKO/AngII）*P（P）<0.05 vs WT/生理盐水，†P（P）通过Kruskal–Wallis检验和Dunn的后验，与WT/AngII相比<0.05。数据归一化为内源性β-肌动蛋白，对于肠系膜动脉，表示为血管平滑肌特异性标记物MYH11的比率。E、 静脉注射苯肾上腺素（100μL，1 mmol/L）前后，用动脉内（颈动脉）压力导管测量麻醉的WT和SMKO小鼠的血压。每组n=4*P（P）与基线相比<0.05。F、 通过无线遥测测量WT和SMKO小鼠对注射去甲肾上腺素（10 mg/kg/天）的压力反应。每组4人*P（P）<0.05 vs WT。AngII表明血管紧张素II；AT1R、AngII受体1型；D、 天；舒张压；心率；MAP，平均动脉压；MYH11，肌球蛋白重链11；收缩压；SMKO，平滑肌sirtuin-1基因敲除；野生型野生型。
图6
图6
AngII导致SMKO主动脉弹性蛋白断裂。盐水和AngII处理的WT和SMKO小鼠的弹性蛋白染色（Van Gieson）主动脉切片（×20）（A）和多光子显微镜下的弹性蛋白纤维微观结构的代表性图片（绿色：弹性蛋白，蓝色：胶原蛋白；图像宽度：306μm）（B）。将显示降序主动脉。C、 来自盐水和AngII处理的WT和SMKO小鼠的弹性蛋白微观结构的定量（单侧Wilcoxon秩和检验*P（P）<0.05 vs WT/AngII；n=4，WT/盐水；n=4，SMKO/生理盐水；n=5，WT/AngII；n=5，SMKO/AngII），基于降主动脉中的弹性蛋白纤维分散。AngII表示血管紧张素II；SMKO，平滑肌SirT1基因敲除；野生型野生型。
图7
图7
SMKO主动脉的机械性能。A、 生理盐水或AngII处理的WT和SMKO小鼠活的、未分离的主动脉环的体外机械试验。n=4，WT/盐水；n=4，SMKO/生理盐水；n=5，WT/AngII；n=5，SMKO/AngII。B、 PWV在体内评估主动脉硬度，单位为米每秒*P（P）<0.05 vs生理盐水；†P（P）<0.05 vs WT/AngII。每组4人。AngII表示血管紧张素II；PWV，脉冲波速；SMKO，平滑肌sirtuin-1基因敲除；野生型野生型。
图8
图8
VSM SirT1阻止主动脉中MMP激活。A、 通过定量RT-PCR评估WT和SMKO（KO）主动脉培养的VSM细胞中MMP2和MMP9 mRNA水平，包括或不包括AngII（100 nmol/L，6小时；每组3个，重复实验）*P（P）<0.05 vs no-AngII对照；†P（P）<0.05 vs WT/AngII。MMP2和MMP9 mRNA表达为褶皱变化与WT/no-AngII对照。B、 凝胶内酶谱的代表性图像表明，主动脉及其培养基中的MMP活性来自盐水或AngII处理的WT和SMKO小鼠，以及在VSM（Tg）中过度表达SirT1的小鼠。每条车道代表1只鼠标；每组4人。AngII表示血管紧张素II；kDa，千道尔顿；基质金属蛋白酶；SMKO，平滑肌SirT1敲除；野生型野生型。
图9
图9
SMKO主动脉和VSM细胞中AngII刺激的氧化剂生成负责MMP激活。A、 AngII输注后3天，WT和SMKO小鼠的DHE染色主动脉切片的代表性图片（n=7，WT/生理盐水；n=5，SMKO/生理盐水，n=5、WT/AngII；n=12，SMKO/AngII），以图形量化*P（P）<0.05 vs WT/生理盐水；†P（P）<0.05 vs WT/AngII，#P（P）与SMKO/AngII相比<0.05。B、 通过DHE荧光和流式细胞仪检测WT和SMKO小鼠培养的VSM细胞中的氧化产物，主要是超氧化物，并用AngII处理。每组n=3，重复实验*P（P）<0.05 vs WT/无AngII；†P（P）<0.05 vs WT/AngII。Tiron（10 mmol/L）是一种超氧物清除剂，用于证明细胞和主动脉切片中DHE荧光的特异性。C、 通过凝胶内酶谱测定，氧化剂清除剂tempol（10 mmol/L）阻止AngII刺激的主动脉中MMP的激活；每个通道代表重复实验中的1只老鼠。D、 显示小鼠主动脉匀浆TIMP-1的三重Western blot代表性图像；每条车道代表一只老鼠。带密度定量，归一化为β-actin，并在图形中表示为任意单位（AU）*P（P）<0.05 vs WT/无AngII；†P（P）<0.05 vs WT/AngII。AngII表示血管紧张素II；DHE，二氢乙炔；KO或SMKO，平滑肌SirT1基因敲除；基质金属蛋白酶；金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-1；血管平滑肌；野生型野生型。
图10
图10
AngII后主动脉中的炎症细胞浸润。A、 CD45百分比+CD11b型+AngII治疗5天后，WT（n=5）和SMKO（n=4）小鼠主动脉匀浆中的细胞通过流式细胞术进行定量。B、 半乳糖凝集素-3（活化巨噬细胞的标志物）和主动脉匀浆中粘附分子VCAM-1的代表性Western blot。每个通道代表一只老鼠，一式三份。带强度的量化用图形中的任意单位（AU）表示*P（P）<0.05 vs生理盐水。AngII表示血管紧张素II；SMKO，平滑肌sirtuin-1敲除；野生型野生型。
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