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.2015年9月15日15:15:638。
doi:10.1186/s12885-015-1645-7。

Coronin 2A（CRN5）表达与大肠腺瘤-腺癌序列和致癌信号相关

拉斐尔·拉塞特 1 2, 马吉特·勃马赫 1, 乌塔挖泥船 三, 马里亚·马尔科 1, 朱利安·贝伦斯 1, 罗克萨娜·索尔加 1, 莎拉·霍杰利 1, 库尔奇·巴塔查里亚 1, 克劳迪娅·蒙德利希 4, F托马斯·温德利希 5, 玛格丽特·奥登塔尔 三, 安贾·齐埃曼 1, 路德维希·艾钦格 1, 克里斯托夫·克莱门 6
附属公司

Coronin 2A（CRN5）表达与大肠腺瘤-腺癌序列和致癌信号相关

拉斐尔·拉塞特等。 BMC癌症. .

摘要

背景：Coronin蛋白被称为基于肌动蛋白的细胞过程的调节器，其中一些与人类癌症的恶性进展有关。在这里，我们表明冠状病毒2A在人类结肠癌中的表达上调。

方法：本研究包括26例人类结肠肿瘤标本和9例正常对照。通过免疫组织化学、免疫荧光成像、细胞分馏和免疫印迹研究冠状病毒2A的表达和定位。通过过表达和敲除该蛋白来分析冠状病毒2A的功能作用。通过共免疫沉淀和下拉实验、质谱分析以及体外激酶和甲基化测定来研究蛋白质相互作用。

结果：组织病理学研究表明，在腺瘤-腺癌进展过程中，结肠肿瘤细胞中coronin 2A的表达上调。在亚细胞水平上，冠状病毒2A定位于多个隔室，即F-actin应力纤维、足爪前部、局灶性粘连和细胞核。冠状病毒2A的过度表达导致F-actin应力纤维减少，细胞迁移速度加快。我们确定了两个新的直接冠状病毒2A相互作用伙伴。coronin 2A与MAPK14（丝裂原活化蛋白激酶14或MAP激酶p38α）的相互作用导致coronin 2A的磷酸化，也导致MAPK14途径的激活。此外，冠状病毒2A与PRMT5（精氨酸N-甲基转移酶蛋白5）相互作用，调节肿瘤细胞对TRAIL诱导的细胞死亡的敏感性。

结论：我们发现冠状病毒2A的表达增加与人类结肠癌的恶性表型相关。此外，我们将冠状病毒2A与参与肿瘤进展的MAPK14和PRMT5信号通路联系起来。

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数字

图1
图1
CRN5在人类结肠癌中过度表达，并且存在于肿瘤细胞亚群的细胞核中。一正常人结肠组织的横切面。结肠上皮细胞(箭头)和基质的成纤维细胞(箭头)不表达CRN5，而组织旁淋巴细胞表现出CRN5的显著表达(双箭头).b条低级别腺瘤切片(右下区域)和高级零件(左上区域). 在较良性的部分，只有单个上皮细胞对CRN5呈微弱阳性(白色箭头). 相反，高级部分的所有上皮细胞都显示出强烈的CRN5细胞溶质染色(箭头). 两部分间质成纤维细胞CRN5阴性(箭头)，淋巴细胞显示标记的CRN5信号(双箭头).c（c）腺癌切片，几乎所有肿瘤上皮细胞都显示出强烈的细胞溶质CRN5表达(箭头). 此外，肿瘤上皮细胞的细胞核中存在CRN5信号(双箭头). 除了淋巴细胞(双箭头)、基质成纤维细胞(箭头)腺癌中CRN5阳性。d日,e（电子）肝和淋巴结转移的切片，细胞质中可见强CRN5信号强度(箭头)和原子核(双箭头)肿瘤上皮细胞。肿瘤间质细胞(箭头)和淋巴细胞(双箭头)CRN5也表达。放大倍率较高的图像(右立柱)除了来自另一个组织样本的高级别腺瘤外，其余均取自同一切片
图2
图2
CRN5定位于细胞核、F-actin应力纤维和脚足。一细胞质和细胞核(箭头)CRN5在CT26小鼠结肠癌细胞中的定位。用pAb H-110进行检测。根据[25]，细胞用4%多聚甲醛固定，用Triton X-100渗透，用0.05%胰蛋白酶处理10分钟以检索表位。二级抗体，山羊抗鼠AlexaFluor 488；DAPI显示细胞核。b条分离出过表达FLAG标记CRN5的HeLa细胞的细胞核，并通过pAb H-110免疫印迹法检测CRN5是否存在。对于对照组，用层粘连蛋白B1（核膜）和α-微管蛋白（细胞质）抗体标记同一膜。c（c）在A7r5主动脉平滑肌细胞中，GFP-CRN5定位于F-actin应力纤维；箭头标记细胞间接触。使用TRITC-球蛋白对F-actin进行可视化。d日在U373人胶质母细胞瘤细胞中，GFP-CRN5与Arp2/3复合物（抗p34抗体）共同定位于跛足前部(箭头).e（电子）,（f）U373人胶质母细胞瘤细胞过度表达GFP-CRN5或GFP-CRN2。虽然GFP-CRN2在包括应力纤维在内的所有F-actin结构中强烈富集，但GFP-CRN5的存在导致F-actin应力纤维的耗竭(星号)并在细胞后部诱导延伸(箭头)
图3
图3
CRN5的表达增加了细胞迁移速度。一慢病毒介导的CRN5特异性shRNA表达导致CT26小鼠结肠癌细胞中CRN5 mRNA和蛋白水平降低约40%。显示了代表性的免疫印迹和琼脂糖凝胶以及相应的密度测定值。CT26对照细胞表达非靶（nt）shRNA。b条与仅表达GFP的对照细胞相比，慢病毒介导的GFP-CRN5在U373人胶质母细胞瘤细胞中过度表达导致CRN5总蛋白水平增加3.8倍。显示了具有代表性的免疫印迹和密度测定值。c（c）CT26细胞表达非靶向或CRN5特异性shRNA（敲除，kd）和(d日)使用过表达GFP或GFP-CRN5的U373细胞进行细胞迁移分析在体外伤口愈合分析。图表显示单个细胞的二维迁移模式。柱状图表示迁移速度和方向性的平均值和标准偏差（CT26细胞系 = 每个96个细胞；U373细胞系，n = 150个细胞）以及伤口闭合（CT26细胞系，n = 每个间隙6个；U373细胞系，n = 每个间隙10个）
图4
图4
MAPK14在丝氨酸423处磷酸化CRN5。一使用单克隆抗体K77-578-1从U373细胞裂解物中免疫沉淀GFP-CRN5。从考马斯染色凝胶中切下83 kDa的GFP-CRN5带，进行质谱分析，在丝氨酸423处鉴定出磷酸化(以黑色突出显示). 下划线，MAPK14磷酸化共识目标基序。以灰色突出显示的氨基酸序列表示质谱法的序列覆盖范围。b条GST-MAPK14表达于大肠杆菌BL21和HEK293细胞。根据磷酸化-MAPK14 pAb D3F9的测定，从后者衍生的MAPK14在Thr180和Tyr182处磷酸化，并且在略高于从细菌衍生的非磷酸化蛋白的分子量下可见。c（c）利用CRN5单克隆抗体K77-578-1与蛋白G包被磁性微球（Miltenyi）耦合进行协同免疫沉淀研究，该磁性微球首先与纯化自大肠杆菌BL21，然后与从HEK293细胞纯化的GST-MAPK14或从大肠杆菌BL21用于控制。采用GST兔pAb[21]免疫印迹法进行分析。d日使用GST-CRN5或GST包衣谷胱甘肽-硫粒与非标记MAPK14进行下拉分析。所有三种重组蛋白均从大肠杆菌BL21作为GST融合蛋白；用TEV蛋白酶从MAPK14中切割标签。使用CRN5 mAb K77-578-1、MAPK14兔pAb和GST pAb进行分析。c（c）,d日为了便于说明，对原始免疫印迹中的车道顺序进行了数字重新排列，以省略不必要的车道。e（电子）免疫荧光图像显示CRN5和MAPK14在跛足足前部富集并共同定位(箭头). 将稳定过表达GFP-CRN5的U373细胞用甲醇固定；用pAb#9212和山羊抗小鼠AlexaFluor 568二级抗体检测MAPK14。（f） 体外利用从HEK293细胞纯化的全长GFP-CRN5和GST标记的MAPK14进行激酶分析。[γ]掺入磷酸盐的时间过程（10、20、60、90分钟）-32P] ATP进入GFP-CRN5。作为对照，使用选择性、ATP-竞争性MAPK14激酶抑制剂SB202190，以及缺乏GST-MAPK14或GFP-CRN5的样品。左面板，放射自显影(32P） ；右图，对应考马斯亮蓝染色凝胶。注意，放射自显影中显示GFP-CRN5的时间依赖性磷酸化的部分对比度设置增加(虚线矩形)，因为MAPK14自身磷酸化的高背景信号
图5
图5
CRN5过度表达激活MAPK14信号通路。一稳定过表达GFP的HEK293细胞作为对照(左上面板)或GFP-CRN5(右上面板)暴露于热休克（42°C下0、15、30分钟）。通过免疫印迹法测定Thr180/Tyr182-磷酸化MAPK14（pp38α）的水平。对照显示热休克实验的总MAPK14（p38α，时间点0分钟/无热休克）和GAPDH(右下面板). 在没有热休克的情况下，在时间点0进行的五次独立分析的密度分析（带有平均值和标准偏差的柱形图；将数值归一化为GAPDH信号并与GFP细胞相关联）显示，表达GFP-CRN5的细胞中MAPK14磷酸化增加了两倍。b条对MAPK14下游选定底物的磷酸化水平的分析表明，表达GFP-CRN5的HEK293细胞中MAPK14通路激活（Thr334-磷酸化MAPKAPK2、Ser82-磷酸化Hsp27、Thr71-磷酸化ATF2、Ser392-磷酸化p53）。加载控制，请参阅中的GAPDH(一,右下面板)
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