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.2015年9月14日；10（9）：e0137612。
doi:10.1371/journal.pone.0137612。 2015年电子收集。

体外构建人脂肪组织的特性：相关脂肪因子分泌及TNF-α的影响

金·奥宾 1, 梅里姆·萨福因 1, 玛丽斯·普鲁克斯 1, 玛丽·爱丽丝·奥德特·卡斯格伦 2, Jean-François科特迪瓦 2, 费利克斯·安德烈·蒂图 三, 阿尔方斯·罗伊 4, 朱莉·弗雷德特 5
附属公司

体外构建人脂肪组织的特性：相关脂肪因子分泌及TNF-α的影响

金·奥宾等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

人体脂肪组织功能的代表性建模是代谢研究的核心。能够在体外生理组织样环境中再现人类脂肪生成的三维模型仍然很少。我们描述了从培养的脂肪基质前体细胞重建白色脂肪组织的工程。我们假设这些重建的组织可以在基础和促炎条件下重现AT的关键功能。这些组织以基质包围的人类脂肪细胞为特征，在长期培养（至少11周）中稳定且代谢活跃。通过重建组织测定主要脂肪因子和生长因子的分泌，并与由人类天然脂肪外植体调节的培养基进行比较。有趣的是，重建脂肪组织的分泌谱表明，瘦素、PAI-1和血管生成素-1蛋白大量产生，而人类脂肪外植体中检测到较高的HGF水平。接下来，我们通过调节MCP-1、NGF和HGF的分泌来证明组织对促炎刺激TNF-α的反应，而VEGF和瘦素蛋白的表达没有变化。TNF-α暴露诱导脂肪细胞代谢相关mRNA（如SLC2A4、FASN和LIPE）以及与NF-κB激活有关的基因表达的变化。最后，该模型被定制为具有代表分化进行阶段的脂肪细胞特征，从而允许使用新分化或更成熟的脂肪细胞进行研究。总之，我们制作了体外工程化三维组织，能够重现皮下白色脂肪组织的关键特征。这些组织是由人类细胞及其新合成的基质元素产生的，没有外源或合成生物材料。因此，它们是研究药物活性产品对人类基质细胞、细胞外基质和分化脂肪细胞的影响以及调节前体细胞脂肪生成的化合物的独特工具。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。hrAT的形态特征。
设计的hrAT的结构外观在体外在Masson三色染色后的组织横截面上显示。（A-C）在培养7天后接受成脂诱导的组织中，可以区分ECM中嵌入的大量脂肪细胞，并在（A）28、（B）49和（C）81天内进行分化。（D） 来自54岁捐赠者的人类天然皮下AT的组织学。（E） 扫描电子显微镜显示富含基质的hrAT中圆形脂肪细胞（分化25天）。箭头指向hrAT的一个区域，显示出薄片状结构。（F） 通过SEM观察58岁供体脂肪细胞的外观。尼罗河红染色后可以观察到（G）hrAT和（H）AT样品脂肪细胞内的脂质。（I）hrAT和（J）native AT上IV型胶原染色显示其位于基底膜。（K） 和（L）分别代表标记hrAT和天然AT的同种抗体对照。星号（*）：毛细血管。
图2
图2。hrAT的长期稳定性在体外.
（A） 在培养期内脂肪细胞的平均表面积，根据28、49或81天后采集的hrAT组织切片测量在体外区别。（B） 脂肪细胞表面积的频率分布取决于脂肪诱导后组织培养的天数。平均值±扫描电镜（SEM）。进行了单因素方差分析（ANOVA），然后进行了Tukey的事后检验，其显著性参考第28天（*）或第49天（#）***P（P）≤0.001, **P（P）≤0.01，*和# P（P）≤0.05. （C） 在培养长达49天的条件下，由重建细胞膜调节的培养基中Ang-1分泌动力学。用与脂肪片相同的细胞制作连接片，但没有脂肪诱导步骤。结果表示为每片3.5厘米的ng/ml/48小时2由三个不同的细胞群体构建的细胞表数据被表示出来（每个时间点N=3，N=2-3）。平均值±标准偏差，#表示每个时间点结缔组织和脂肪层之间的统计差异(P（P）≤0.05，未配对t吨-而星号（*）表示同一细胞群内连续数周的比较表明所有三个群体在连续几周之间都有显著差异。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验****P（P）≤0.0001, ***P（P）≤0.001, **P（P）≤0.01，*和& P（P）≤0.05。
图3
图3。AT外植体和重建组织分泌关键脂肪因子。
用ELISA分析AT外植体（6个供体，每个供体3–6个）、hrAT（28天分化）及其未分化hrCT对应物（4个，2–3个）处理48小时的培养基。测定（A）瘦素、（B）PAI-1、（C）Ang-1、（D）VEGF和（E）HGF的分泌水平。数据表示为48小时内分泌的分子pg/ml，由总DNA含量归一化（平均值±SEM）。每个数据点代表从不同的供体/人群获得的许多样本的平均值（表1）。（F） 总DNA含量测定。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验***P（P）≤0.001, **P（P）≤0.01, *P（P）≤0.05. ND=未检测到。
图4
图4。TNF-α对重建组织和AT外植体分泌脂肪因子的影响。
（A） 暴露于TNF-α后MCP-1的剂量依赖性释放。脂肪细胞片在10或100 ng/ml TNF-α存在下培养24 h，条件培养基通过ELISA分析。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验***P（P）与对照组相比≤0.001，## P（P）与10 ng/ml TNF-α相比≤0.01。（B） 脂肪片暴露于10或100 ng/ml TNF-α24小时后，MCP-1、游离NGF、HGF、VEGF和瘦素的蛋白表达比对照组增加了倍。（C） 将结缔组织片暴露于10或100 ng/ml TNF-α24小时后，与对照组相比，MCP-1、HGF和VEGF的蛋白表达增加。对于每个分子，一个样品t吨-试验参照未经处理的板材（比例为1）进行。对于B和C，先进行单向方差分析，然后进行Dunnett的事后检验****P（P）≤0.0001时***P（P）≤0.001, **P（P）≤0.01. （D） 暴露于10 ng/ml TNF-α24小时后结缔细胞和脂肪细胞膜分泌的MCP-1、HGF和VEGF的比较量（ng/ml）。每列中的虚线表示相应分泌蛋白的模拟处理结缔组织和脂肪层的基本水平。#表示结缔组织和脂肪层之间这些基础水平的统计学显著性，而星号（*）表示组织类型之间的显著性****P（P）≤0.0001, **P（P）≤0.01, *P（P）≤0.05. 注意，瘦素不是由结缔组织片或hrCT产生的。（E） 将人AT外植体暴露于10ng/ml TNF-α24小时后，MCP-1、HGF、VEGF和瘦素的蛋白表达比对照组增加数倍。根据外植体的重量进行数据归一化。
图5
图5。以代表不同分化阶段的脂肪细胞为特征的hrAT工程。
（A） 产生hrAT的诱导方案示意图如（C）所示。（B） 根据静态或动态培养条件对脂肪片进行油红O染色后进行细胞内脂质定量。在有AsA存在的培养的不同时间（第7天、第14天或第21天）进行脂肪生成诱导，在14天的固定时间内进行油红O染色，在此期间进行脂质积累*P（P）≤0.05，单因素方差分析，然后进行Tukey的事后检验；### P（P）= 0.0003,&& P（P）=0.0013，成对t吨-在指定的诱导日进行动态和静态条件之间的测试。（C） 根据在动态培养条件下诱导脂肪生成的日期，hrCT（无脂肪细胞）和hrAT的组织横截面以较小或更发达的脂肪细胞为特征。石蜡包埋的hrAT样品上的Masson三色染色（左）显示存在大量脂肪细胞（空隙）和重要的ECM含量（蓝色），而甲醛固定冰冻切片上的油红O染色（右）显示发育中的脂肪细胞积聚细胞内脂质。棒材=100μm。
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