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.2015年9月；3（9）：e12510。
doi:10.14814/phy2.12510。

Shank2调节肾白蛋白内吞

叶夫根妮娅·多布林斯基 1, 琳达·刘易斯 1, R Brian医生 2, 冈村佳彦 1, 李敏古 三, 克里斯托弗·阿尔特曼 1, 莎拉·福贝尔 1, 杰弗里·B·科普 4, 朱迪思·布莱恩 5
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Shank2调节肾白蛋白内吞

叶夫根妮娅·多布林斯基等。 生理学代表. 2015年9月.

摘要

白蛋白尿是肾脏疾病进展的一个强有力的独立预测因子，但肾脏处理白蛋白的机制尚待完全确定。以前的研究表明足细胞内吞白蛋白。在这里，我们证明Shank2是一种最初在神经元突触后密度确定的大支架蛋白，在体内和体外足细胞中表达，并在足细胞的白蛋白内吞中发挥重要作用。在培养的人足细胞中敲除Shank2会降低白蛋白的摄取，但由于敲除的足细胞中仍存在残余Shank2，因此这种降低不太可能具有统计学意义。足细胞中Shank2的完全敲除显著降低了体外白蛋白摄取。Shank2基因敲除小鼠在8周龄时出现蛋白尿。为了检测野生型和Shank2基因敲除小鼠体内的白蛋白处理，我们使用了多光子活体成像。虽然注射后在野生型小鼠的肾小管中快速发现FITC-标记的白蛋白，但在Shank2基因敲除小鼠的肾微管中几乎没有发现白蛋白，这表明Shank2敲除小鼠肾白蛋白运输失调。我们之前发现，小窝蛋白-1是培养足细胞内吞白蛋白所必需的。Shank2基因敲除小鼠足细胞中小窝蛋白-1的表达显著降低，定位发生改变，表明Shank2敲除小鼠白蛋白内吞的破坏是通过小窝蛋白1介导的。总之，我们已经确定Shank2是足细胞白蛋白内吞途径的另一个组成部分。

关键词：高级成像；蛋白尿；内吞作用；支架蛋白。

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数字

图1
图1
Shank2在体内外足细胞中表达。（A） 大鼠肾小球足细胞Shank2（绿色）的免疫荧光（箭头）。肌动蛋白被染成蓝色。酒吧–10μm.（B）人类足细胞Shank2（绿色）的免疫荧光。肌动蛋白被染成蓝色。我们无法使用IF在小鼠足细胞中证明Shank2染色，因为我们的Shank2抗体对小鼠组织中的IF不起作用（但对western blot有效，见图5B）。酒吧–10μ米。
图2
图2
蛋白内体、不同内体隔室和Shank2的关联。用FITC-白蛋白处理足细胞(绿色; 10分钟；37°C），固定并染色Shank2（r预计起飞时间)带（B）EEA1(蓝色)，（C）灯1(蓝色)和F-肌动蛋白(蓝色). FITC白蛋白部分共定位(箭头)具有早期内体和溶酶体。Shank2也在同一地方(箭头)含FITC-白蛋白的内体。酒吧–10μm、 所有图像使用相同的放大倍数。（D–F）强度相关系数分析表明，白蛋白与早期内体和溶酶体的共定位程度存在空间依赖性，但与Shank2无关。图表横坐标表示覆盖滑移水平以上的微米级。（D） Shank2共定位在所有水平的足细胞中保持不变，但对于（E）EEA1和（F）LAMP1，共定位在足细胞上游减少。
图3
图3
Shank2敲除降低足细胞的白蛋白摄取。（A） 感染非靶控或Shank2 shRNA的培养人足细胞的Western blot分析。Shank2在？250 kD和150 kD处出现条带。（B） 使用慢病毒shRNA对Shank2基因敲除进行密度分析。Shank2在感染Shank2 shRNA的足细胞中的表达显著降低至对照水平的46±16%(P（P） < 0.01)P（P）对照组（shControl）与Shank2敲除组（shShank2）足细胞FITC-白蛋白摄取的Western blot分析。（D） 对照组（shControl）与Shank2击倒足细胞（shShank2）FITC-白蛋白摄取的密度分析。强度标准化为shNTC 0 h条件。与非靶向对照组相比，Shank2敲除使FITC-白蛋白摄取减少36±23%(P（P）摄入1小时后<0.1），摄入2小时后与非目标对照组相比增加40±24%(P（P）<0.07），尽管如前所述，这些减少没有达到统计显著性(n个= 3个实验）。
图4
图4
Shank2基因敲除抑制足细胞中的白蛋白摄取。（A） 从Shank2基因敲除小鼠分离的足细胞不表达Shank2。（B） 在4°C（抑制内吞作用，允许结合）或37°C（允许内吞作用）下与FITC-白蛋白孵育的野生型或Shank2敲除足细胞裂解产物的代表性western blot。（C） 野生型或Shank2敲除足细胞细胞裂解物中FITC-白蛋白含量的密度分析。野生型或Shank2基因敲除足细胞的强度标准化为37°C，0小时*P（P） < 0.05,n个=3个独立实验。
图5
图5
Shank2基因敲除小鼠体内的白蛋白运输受到损害。（A） 野生型尿白蛋白归一化为肌酐(n个= 5） 和Shank2 KO小鼠(n个= 7). （B） Shank2敲除小鼠在肾皮质中没有Shank2表达。（C） 透射电子显微镜（TEM）显示野生型小鼠的正常足突（箭头）。（D） 相反，TEM显示Shank2 KO中足细胞足突变宽，轻度足细胞足突消失（箭头）。（E） TEM显示野生型小鼠近端小管细胞顶端表面有丰富的内吞小泡（箭头所示）。（F） Shank2基因敲除小鼠的近端肾小管顶端膜上的小泡（箭头）明显较少。（G） 注射FITC-白蛋白15分钟后拍摄的活体内多光子图像显示，在野生型小鼠（箭头）肾小管细胞刷状缘下方有FITC-蛋白。在一些细胞中，内部化的FITC-白蛋白定位于细胞的基底面附近（箭头所示）。（H） 相反，向Shank2基因敲除小鼠注射FITC-白蛋白15分钟后，大多数肾小管不含白蛋白。在少数细胞中，注射的FITC-白蛋白似乎卡在刷子边缘，聚集在大的小泡中（图5H，箭头）。酒吧–20μ米。
图6
图6
Shank2基因敲除足细胞中Caveolin-1表达改变。（A） Western blot分析表明，与野生型相比，Shank2基因敲除足细胞中小窝蛋白-1的表达降低。密度分析表明敲除足细胞中小窝蛋白表达减少70±6%(*P（P） < 0.05,n个=3个实验）。（B） 典型的免疫荧光图像表明，与野生型相比，小窝蛋白-1在Shank2基因敲除足细胞中定位错误，远离细胞边缘。酒吧–10μ米。
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