Distinct partitioning of ALS associated TDP-43, FUS and SOD1 mutants into cellular inclusions

doi:10.1038/srep13416

.2015年8月21:5:13416。

doi:10.1038/srep13416。

ALS相关TDP-43、FUS和SOD1突变体明显分裂为细胞内含物

娜塔莉·法拉维尔^1 2, 伊莎贝拉·兰贝特·史密斯^1 2, 萨达夫·T·瓦拉伊赫^三, 伊恩·布莱尔^三, 达伦·N·桑德斯^4 5, 丹尼·M·哈特斯⁶, 贾斯汀·叶伯里^1 2

附属公司

¹澳大利亚新南威尔士州2522 Wollongong，Illawarra Health and Medical Research Institute。
²澳大利亚新南威尔士州伍伦贡市伍伦贡大学科学、医学与健康学院2522。
^三澳大利亚新南威尔士州悉尼麦格理大学澳大利亚高等医学院，邮编：2109。
⁴澳大利亚新南威尔士州达林赫斯特市金霍恩癌症中心加文医学研究所癌症科，2010年。
⁵新南威尔士州医学院圣文森特临床学校。
⁶墨尔本大学，墨尔本，维多利亚州3010，澳大利亚。

PMID： 26293199
预防性维修识别码：项目经理4544019
内政部： 10.1038/srep13416

ALS相关TDP-43、FUS和SOD1突变体明显分裂为细胞内含物

娜塔莉·法拉维尔等。科学代表. 2015.

.2015年8月21:5:13416。

doi:10.1038/srep13416。

作者

娜塔莉·法拉维尔^1 2, 伊莎贝拉·兰贝特·史密斯^1 2, 萨达夫·T·瓦拉伊赫^三, 伊恩·布莱尔^三, 达伦·桑德斯^4 5, 丹尼·M·哈特斯⁶, 贾斯汀·叶伯里^1 2

附属公司

¹澳大利亚新南威尔士州2522 Wollongong，Illawarra Health and Medical Research Institute。
²澳大利亚新南威尔士州伍伦贡市伍伦贡大学科学、医学和健康学院，邮编2522。
^三澳大利亚新南威尔士州悉尼麦格理大学澳大利亚高等医学院，邮编：2109。
⁴加文医学研究所癌症科，金霍恩癌症中心，新南威尔士州达令赫斯特，2010年，澳大利亚。
⁵新南威尔士州医学院圣文森特临床学校。
⁶墨尔本大学，墨尔本，维多利亚州3010，澳大利亚。

PMID： 26293199
预防性维修识别码：项目经理4544019
内政部： 10.1038/报告13416

摘要

肌萎缩侧索硬化症是一种进展迅速的神经退行性疾病，与蛋白质错误折叠和聚集有关。大多数病例的特征是TDP-43阳性内含物，而少数家族性ALS病例分别为FUS和SOD1阳性。细胞可以产生可变类型的内含物，包括之前描述的聚集蛋白、IPOD或JUNQ结构，这取决于错误折叠的蛋白质。SOD1总是形成JUNQ内含物，但其他ALS蛋白聚集体是作为上述内含物类型之一出现还是形成独特结构尚不清楚。这里我们显示，FUS可变地分为IPOD、JUNQ或交替结构，包含一个可移动部分，不依赖微管，最初不包含泛素。TDP-43包裹体以微管独立的方式形成，不含可移动部分，但可变地与JUNQ包裹体和另一种替代结构共定位。我们的结论是，RNA结合蛋白TDP-43和FUS并不始终符合当前特征包涵体模型，这表明细胞具有比目前认为的更大的生成包涵体的储备，并暗示ALS的毒性并非源于特定的聚集过程或聚集结构。

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数字

**图1。聚合突变TDP-43和FUS招募TDP-43^重量.**
用TDP-43瞬时转染NSC-34细胞^重量-番茄及48天后的共焦显微镜检查小时。(A类)突变型TDP-43^M337伏-GFP与TDP-43共表达^重量-番茄。(B类)突变型FUS^R495倍与TDP-43共表达^重量-番茄。(C类)SOD1标准^A4V型与TDP-43共转染^重量番茄。白色箭头表示GFP和番茄标记蛋白的共定位区域。白色箭头表示仅包含一个标记蛋白质的独特包涵体结构。(D类)突变体TDP-43、FUS和SOD1与TDP-43共定位的具有聚集体的细胞比例^重量。数据来自3个独立实验，Z检验用于比较比例差异**p < 0.01，***p < 0.001.

**图2。微管失稳可阻止SOD1夹杂物，但不能阻止TDP-43和FUS夹杂物。**
用突变的TDP-43、FUS或SOD1-GFP瞬时转染NSC-34细胞，24天后有或无33小时孵育 μM诺卡唑。(A类)在诺康唑存在或不存在的情况下表达GFP融合蛋白的细胞的共焦图像。虚线表示细胞轮廓，实线表示从透射图像中获得的核轮廓（表示为N），白色箭头表示夹杂物。(B类)转染细胞中含有内含物的细胞比例的量化。对每个时间点的至少6个视野进行计数（每个视野至少30个单元格）并进行评分。实验进行了3次，条形图表示平均值和标准偏差。**表示p < 0.01 (C类)用诺卡唑处理后，对细胞进行裂解，并将裂解产物用于滤器捕集试验。捕获的材料代表骨料。Western blotting对产生的滤过阱分析进行印迹，并使用imageJ进行量化。实验进行了3次，条形图表示平均值和标准偏差**表示p < 0.01.

**图3。SOD1和FUS包裹体包含一个可移动部分。**
对表达突变TDP-43、FUS或SOD1-GFP的NSC-34细胞中形成的内含物进行FRAP分析。(A类)随时间绘制的平均荧光强度（ROI内）。记录漂白前的强度，并记录多达40次的恢复 s.结果为n的平均值和标准偏差 = 10.40时的平均荧光 s用直方图量化***表示p < 0.001. (B类)漂白前、漂白后和恢复终点的典型共焦图像。ROI标记为白色，图像相对于数据采集的时间标记在面板A中。

**图4。SOD1和TDP-43包裹体与iPOD不同。**
Htt转染细胞_例146Q mcherry和突变体TDP-43、FUS或SOD1-GFP。细胞成像48 转染后h(A类)然后量化共定位或围绕Htt iPOD的夹杂物数量(B类). 绿色箭头表示不同且独立的包裹体，红色箭头表示Htt包裹体周围的GFP标记包裹体，黄色箭头表示同位化。在每种情况下，至少计数100个含有内含物的细胞，并重复实验n次 = 2.对组合数据集进行比例z检验，***表示p < 0.001. (C类)对Htt-FUS阳性内含物进行FRAP测量。白色方框表示ROI，箭头表示漂白区域。平均荧光强度为80 s和所示数据为平均值和标准偏差n = 6.直方图是来自FUS和Htt的数据，在80 与单独的FUS-GFP或Htt-RFP相比***表示p < 0.001.

**图5。突变体TDP-43可以共同聚集成JUNQ样的SOD1阳性结构。**
将突变的SOD1、TDP-43和FUS联合转染NSC-34细胞，48天后成像小时(A类). 在某些情况下，可以发现突变TDP-43与SOD1共定位。(B类)利用FRAP分析突变SOD1和TDP-43阳性内含物。白色方框表示ROI，箭头表示漂白区域。平均荧光强度为80 s和显示的数据是平均值和标准偏差n = 6.直方图是来自SOD1和TDP-43的数据，在80 与SOD1-GFP或TDP-43番茄相比。(C类)利用FRAP分析突变FUS和TDP-43阳性内含物。白色方框表示ROI，箭头表示漂白区域。平均荧光强度为80 s和显示的数据是平均值和标准偏差n = 6.直方图是来自FUS和TDP-43的数据，在80℃时共定位与FUS-GFP或TDP-43番茄相比*表示p < 0.05. (D类)利用FRAP分析突变FUS和SOD1阳性内含物。白色方框表示ROI，箭头表示漂白区域。平均荧光强度为80 s和显示的数据是平均值和标准偏差n = 9.直方图是来自FUS和SOD1的数据，在80时共定位与单独的FUS-GFP或SOD1-tomota相比。

**图6。三重转染显示3种不同的内含物。**
用SOD1、TDP-43和Htt联合转染NSC-34细胞，包括三种质粒的三重转染，48天后成像小时。

**图7。与SOD1相比，泛素与TDP-43和FUS内含物的结合较晚。**
用突变的TDP-43、FUS或SOD1-GFP和mRFP-泛素瞬时转染NSC-34细胞，转染后不同时间用共焦显微镜检查(A类–C类). 含有GFP融合蛋白和泛素的双转染细胞内含物比例的量化(D类). 对每个时间点的8个视场进行计数（每个视场至少30个细胞）并进行评分。实验一式三份，是两个独立实验的代表。(E类)对人类ALS死后组织进行TDP-43和泛素染色。对两例散发性ALS患者的40个包涵体进行成像。显示了小病灶（未与泛素共定位）和与泛素染色共定位的大骨架的典型图像。

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1. Rosen D.R.等。Cu/Zn超氧化物歧化酶基因突变与家族性肌萎缩侧索硬化症有关。《自然》362，59–62（1993）。-公共医学
1. Kwiatkowski T.J.Jr等人。16号染色体上FUS/TLS基因的突变导致家族性肌萎缩侧索硬化症。《科学》3231205-1208（2009）。-公共医学
1. Vance C.等人，一种RNA处理蛋白FUS的突变会导致家族性肌萎缩侧索硬化症6型。《科学》3231208-1211（2009）。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Nishimura A.L.等人。囊泡运输蛋白VAPB的突变导致迟发性脊髓肌萎缩和肌萎缩侧索硬化。《美国人类遗传学杂志》75，822-831（2004）。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Kabashi E.等人。散发性和家族性肌萎缩侧索硬化患者的TARDBP突变。《自然遗传学》40，572-574（2008）。-公共医学

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[1] Rosen D.R.等。Cu/Zn超氧化物歧化酶基因突变与家族性肌萎缩侧索硬化症有关。《自然》362，59–62（1993）。-公共医学

[2] Rosen D.R.等。Cu/Zn超氧化物歧化酶基因突变与家族性肌萎缩侧索硬化症有关。《自然》362，59–62（1993）。-公共医学

[3] Kwiatkowski T.J.Jr等人。16号染色体上FUS/TLS基因的突变导致家族性肌萎缩侧索硬化症。《科学》3231205-1208（2009）。-公共医学

[4] Kwiatkowski T.J.Jr等人。16号染色体上FUS/TLS基因的突变导致家族性肌萎缩侧索硬化症。《科学》3231205-1208（2009）。-公共医学

[5] Vance C.等人，一种RNA处理蛋白FUS的突变会导致家族性肌萎缩侧索硬化症6型。《科学》3231208-1211（2009）。-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Vance C.等人，一种RNA处理蛋白FUS的突变会导致家族性肌萎缩侧索硬化症6型。《科学》3231208-1211（2009）。-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Nishimura A.L.等人。囊泡运输蛋白VAPB的突变导致迟发性脊髓肌萎缩和肌萎缩侧索硬化。《美国人类遗传学杂志》75，822-831（2004）。-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Nishimura A.L.等人。囊泡运输蛋白VAPB的突变导致迟发性脊髓肌萎缩和肌萎缩侧索硬化。《美国人类遗传学杂志》75，822-831（2004）。-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Kabashi E.等人。散发性和家族性肌萎缩侧索硬化患者的TARDBP突变。《自然遗传学》40，572-574（2008）。-公共医学

[10] Kabashi E.等人。散发性和家族性肌萎缩侧索硬化患者的TARDBP突变。《自然遗传学》40，572-574（2008）。-公共医学

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