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.2015年10月8日；126(15):1844-55.
doi:10.1182/bloud-2015-01-625707。 Epub 2015年8月18日。

循环凝血酶原的遗传减少改善镰状细胞病小鼠的多器官病理

Paritha I Arumugam公司 1, 埃里克·S·马林斯 2, Shiva Kumar Shanmukhappa公司 三, 布雷特·莫尼亚 4, 阿纳斯塔西亚·洛贝里 1, 莫林·A·肖 2, 蒂拉特·里兹维 1, 贾纳卡·万萨普拉 5, 杰伊·L·德根 1, 普纳姆·马利克 6
附属公司

循环凝血酶原的基因减少改善镰状细胞病小鼠的多器官病理

Paritha I Arumugam公司等。 血液. .

摘要

镰状细胞病（SCD）会导致血管闭塞、慢性溶血性贫血和累积性器官损伤。SCD的一个显著特征是慢性炎症和凝血系统激活。凝血酶（因子IIa[FIIa]）既是止血的中心蛋白酶，也是炎症过程的关键调节因子。为了探索SCD中凝血酶原（因子II[FII]）水平降低将限制血管闭塞、血管病变和炎症的假设，我们使用了两种策略来抑制SCD小鼠的FII。每周给Berkeley SCD小鼠注射FII反义寡核苷酸“gapmer”，以选择性地将循环FII水平降低至正常值的～10%，持续15周，可显著降低早期死亡率。使用循环FII基因减少的小鼠进行了更全面的长期比较研究。在这里，通过造血干细胞移植实施SCD后的一年内，对FII（lox/-）小鼠（组成性携带约10%的正常FII）和FII（WT）小鼠进行了平行追踪。这种基因强加的FII水平抑制导致炎症显著减少（白细胞增多、血小板增多和循环白细胞介素-6水平降低），内皮细胞功能障碍减少（内皮细胞活化和循环可溶性血管细胞粘附分子减少），SCD相关终末器官损伤（肾病、肺动脉高压、肺部炎症、肝功能、炎症浸润和微梗死）显著改善。值得注意的是，在没有出血并发症的情况下，凝血酶原时间相对温和地增加了1.25倍，实现了所有这些益处。综上所述，这些数据证实了凝血酶原是SCD诱导的终末器官损伤的有力调节剂，并为改善SCD病理提供了新的治疗靶点。

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图1
图1
使用ASO减少循环FII可降低伯克利镰状小鼠的早期死亡率。（A） Western blot分析显示，代表性伯克利镰状小鼠从3周龄开始服用对照ASO（n=4，1-4道）或FII-特异ASO（n=4，6-9道），并在15周龄时处死进行FII分析，其循环FII蛋白水平。典型未治疗FII患者的血浆FII水平重量（第5车道）和未经处理的FII液氧/−（第10车道）小鼠也被显示为用于比较的额外对照。（B） 伯克利镰状小鼠的PT从3周龄开始给药对照ASO或FII ASO，并在15周龄时处死进行血浆分析。每个符号代表一只动物，条形图表示中值。数据采用Mann-Whitney U检验进行分析**P（P）< .01. （C） 从3周龄开始给予FII ASO（n=20）或对照ASO（n=20）并持续每周ASO治疗至15周龄的伯克利镰状小鼠队列的Kaplan-Meier生存分析。相同数量的男性和女性被纳入对照组ASO或FII特定ASO管理。在早期死亡的镰状小鼠中，雄性与雌性的比例为1:1。使用对数秩（Mantel-Cox）检验对生存曲线进行比较*P（P）< .05.
图2
图2
含有10%循环FII的镰刀嵌合体表现出PT适度增加，凝血激活证据减少。（A） FII中的PT值重量小鼠（100%循环FII）和FII液氧/−小鼠（FII水平为~10%）和FII队列重量和FII液氧/−用表达HbA（HbA/FII）的供体Berkeley小鼠骨髓移植小鼠重量和HbA/FII液氧/−)或供体Berkeley镰状小鼠表达HbS（HbS/FII重量和HbS/FII液氧/−). （B） HbS/FII中的D-二聚体水平重量、HbS/FII液氧/−，HbA/FII重量和HbA/FII液氧/−老鼠。条形图表示中间值。每个符号代表一种动物。用作移植受体的小鼠年龄相似（8-10周），实验组中分布着相同数量的雄性和雌性。移植后对完全嵌合的镰状或正常小鼠进行为期一年的随访。采用Mann-Whitney U检验对队列进行分析，FII之间的统计显著性重量和FII液氧/−嵌合体用星号表示：**P（P）< .01, *P（P）< .05.
图3
图3
通过基因强制降低循环FII的镰刀嵌合体显示出显著的炎症降低。HbS/FII中的总（A）WBC、（B）中性粒细胞、（C）单核细胞和（D）血小板计数重量、HbS/FII液氧/−，HbA/FII重量，和HbA/FII液氧/−展示的是老鼠。（E） HbS/FII患者血浆IL-6和（F）血浆sVCAM-1水平重量、HbS/FII液氧/−，HbA/FII重量和HbA/FII氧/−队列。每个符号代表一种动物。用作移植受体的小鼠年龄相似（8-10周），实验组中分布着相同数量的雄性和雌性。移植后对完全嵌合的镰状或正常小鼠进行为期一年的随访。各组雌性小鼠的sVCAM-1水平与雄性小鼠相比呈下降趋势。在雄性小鼠中，sVCAM-1水平为HbS/FII重量与HbS/FII相比液氧/−小鼠为17965±3406 ng/mL vs 12 分别为870±338 ng/mL。在雌性小鼠中，HbS/FII中sVCAM-1的水平重量与HbS/FII相比液氧/−老鼠只有13只 009±1361纳克/毫升vs 10 分别为914±937纳克/毫升。不同组中两种性别之间的差异无统计学意义。采用Mann-Whitney U检验对队列进行分析，FII之间的统计显著性重量和FII液氧/−嵌合体用星号表示：**P（P）< .01, *P（P）< .05, ***P（P）< .001.
图4
图4
低FII水平的镰刀嵌合体可防止肾脏损伤和镰刀肾病。HbS/FII之间具有代表性的H&E肾脏切片比较重量（左面板）和HbS/FII液氧/−（右面板）小鼠出现（A）缺血、炎性细胞浸润和肾瘢痕（×10目标）。HbS/FII中的（B-C）FSGS和肾小球萎缩（箭头所示）重量肾小球与HbS/FII的比较液氧/−肾小球。（D-E）PAS染色显示HbS/FII肾小球基底膜增厚重量肾小球与HbS/FII的比较液氧/−肾小球。（F） 肾小管的典型H&E染色切片显示肾小管丢失、炎性细胞浸润（用虚线表示）和再生小管。（B-F）目标，×60。（G-J）组织学特征的半定量评估。组织学评分范围为0-5，其中0表示肾脏形态正常；肾小球面积变化<15%；2、肾小球面积的20%～30%；3、肾小球面积的40%至50%；4，～60%～70%的肾小球面积；大多数肾小球发生严重变化。（K） 尿白蛋白和（L）尿渗透压值。用作移植受体的小鼠年龄相似（8-10周），实验组中分布着相同数量的雄性和雌性。移植后对完全嵌合的镰状或正常小鼠进行为期一年的随访。每个符号代表一种动物。采用Mann-Whitney U检验对组织学评分进行统计分析。HbS/FII之间的统计显著性重量（n=6）和HbS/FII液氧/−（n=7）小鼠用星号表示：****P（P）< .0001, ***P（P）< .01, **P（P）< .01, *P（P）< .05.
图5
图5
FII水平基因降低的镰刀嵌合体改善了心肺病理和功能。（A） 代表HbA/FII的CMR重量、HbS/FII重量和HbS/FII液氧/−小鼠骨髓移植后1年。心室的代表性视图显示为RV位于同一平面，红色箭头表示。（B-C）嵌合小鼠的左心室和右心室舒张末期容积；符号表示每个鼠标的值，条形表示平均值。（D） RV肥厚是以HbS/FII中RV壁重量/LV+隔膜重量（Fulton指数）的比率来测量的重量（n=12），HbS/FII液氧/−（n=15），HbA/FII重量（n=6），HbA/FII氧/−（n=7）只小鼠。队列采用Mann-Whitney U检验进行分析。FII之间的统计显著性重量和FII液氧/−嵌合体用星号表示：**P（P）＜0.01*P（P）< .05. （E） 肺组织α-SMA染色。图片代表每组5至7只小鼠。用作移植受体的小鼠年龄相似（8-10周），实验组中分布着相同数量的雄性和雌性。移植后对完全嵌合的镰状或正常小鼠进行为期一年的随访。
图6
图6
具有10%正常FII水平的镰刀嵌合体可减轻肺部病理。HbS/FII的代表性肺切片重量小鼠（左侧面板）与HbS/FII的比较液氧/−小鼠（右侧面板）显示：（A）HbS/FII炎症浸润增加重量肺与HbS/FII的比较液氧/−肺。目标，×10。（B） HbS/FII中肺泡巨噬细胞增加重量肺与HbS/FII的比较液氧/−肺。目标，×40。（C） HbS/FII血管周围水肿加重重量肺与HbS/FII缺乏液氧/−肺。目标，×40。黑色箭头表示每个面板中描述的病理学。图像代表了每个实验组6到9只小鼠。用作移植受体的小鼠年龄相似（8-10周），实验组中分布着相同数量的雄性和雌性。移植后对完全嵌合的镰状细胞或正常小鼠进行一年的随访。
图7
图7
FII水平基因降低的镰刀嵌合体改善了肝脏形态、功能，减少了血管闭塞。HbS/FII的代表性H&E肝脏切片重量（左侧面板，A-D）和HbS/FII液氧/−（右图，A-D）在不同放大倍数下观察骨髓移植后1年的小鼠（目标：A，×10；B，×20；C，×40；和D，×60），显示HbS/FII中多灶性凝固性肝坏死，偶尔伴有严重充血的血管（图C中箭头所示）重量老鼠。HbS/FII中坏死区域用虚线（A-B，D）标记，浸润白细胞用箭头（D）标记重量老鼠。HbS/FII中液氧/−小鼠的凝血坏死区域很小，充血血管相对较少。肝血管内皮细胞（F-H）CD31染色显示HbS/FII血管充血重量小鼠（箭头所示）以及突出的圆形内皮细胞（H）。HbS/FII的这些变化很小液氧/−老鼠。HbA/FII肝切片的微血管密度（MVD）无差异重量和HbA/FII液氧/−老鼠。（F-G）目标，×40。（H） 目标，×100。图片代表了每个实验组9只小鼠。（E） HbS/FII患者血清丙氨酸转氨酶（ALT）活性重量、HbS/FII液氧/−，HbA/FII重量和HbS/FII液氧/−老鼠。每个符号代表一个单独的动物，线条代表中间值。用作移植受体的小鼠年龄相似（8-10周），实验组中分布着相同数量的雄性和雌性。移植后对完全嵌合的镰状或正常小鼠进行为期一年的随访。通过Mann-Whitney U检验对队列进行分析，FII之间的统计学显著性重量和FII液氧/−嵌合体用星号表示：*P（P）< .05. 不另作说明，不重要。
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中的注释

  • 这是SCD的“PT”！
    鲍林斯基R。 帕林斯基R。 鲜血。2015年10月8日；126(15):1739-40. doi:10.1182/bloud-2015-08-666594。 鲜血。2015 PMID：26450955

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