Ablation of Doublecortin-Like Kinase 1 in the Colonic Epithelium Exacerbates Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis

doi:10.1371/journal.pone.0134212

.2015年8月18日；10（8）：e0134212。

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硫酸右旋糖酐钠诱导结肠炎中双皮质激素样激酶1的消融作用

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¹美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心医学系，邮编73104；美国俄克拉何马州俄克拉荷马市退伍军人事务部医疗中心，邮编73104；佩吉和查尔斯·斯蒂芬森（Charles Stephenson），俄克拉荷马癌症中心，俄克拉荷马州，俄克拉何马市，邮编73104，美利坚合众国。
²美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心医学系，邮编73104。
^三美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心医学系，邮编73104；美国俄克拉何马州俄克拉荷马市退伍军人事务医疗中心，邮编73104。
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⁵首都医科大学北京朝阳医院肿瘤科，北京，100020。
⁶美国俄克拉何马州俄克拉荷马市COARE生物技术公司，邮编73104。
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结肠上皮中双皮质素样激酶1的消融可加重硫酸葡聚糖钠诱导的结肠炎

东风区等。公共科学图书馆一号. 2015.

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¹美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心医学系，邮编73104；美国俄克拉何马市退伍军人事务医疗中心，73104；Peggy and Charles Stephenson俄克拉何马州癌症中心，俄克拉何马市，美国，73104。
²美国俄克拉何马州俄克拉何马市俄克拉何马大学健康科学中心医学系，邮编73104。
^三美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心医学系，邮编73104；美国俄克拉何马州俄克拉荷马市退伍军人事务医疗中心，邮编73104。
⁴美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心医学系，邮编73104；佩吉和查尔斯·斯蒂芬森（Charles Stephenson），俄克拉荷马癌症中心，俄克拉荷马州，俄克拉何马市，邮编73104，美利坚合众国。
⁵首都医科大学北京朝阳医院肿瘤科，北京，100020。
⁶美国俄克拉何马州俄克拉荷马市COARE生物技术公司，邮编73104。
⁷美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心医学系，邮编73104；美国俄克拉何马州俄克拉荷马市退伍军人事务部医疗中心，邮编73104；佩吉和查尔斯·斯蒂芬森（Charles Stephenson），俄克拉荷马癌症中心，俄克拉荷马州，俄克拉荷马市，邮编73104，美利坚合众国；美国俄克拉何马州俄克拉荷马市COARE生物技术公司，邮编73104。

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内政部： 10.1371/新闻稿.0134212

摘要

双皮质素样激酶1（Doublecortin-like kinase 1，Dclk1）是一种微管相关激酶，是称为簇状细胞（tuft cells）的肠上皮细胞的第五个谱系，在Apc突变型结肠癌模型中充当肿瘤干细胞。为了确定Dclk1在右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎症中的作用，肠上皮特异性Dclk1-deficient（VillinCre；Dclk1f/f）和对照（Dclk-1f/f。对DSS诱导的结肠炎的临床和组织学特征进行评分，并使用免疫组织化学、基因表达、促炎细胞因子/趋化因子和免疫印迹分析来检查上皮屏障完整性、炎症以及干细胞和簇状细胞特征。在DSS诱导的结肠炎中，VillinCre；Dclk1f/f小鼠的损伤加重，包括临床结肠炎评分升高、上皮屏障通透性增加、促炎细胞因子和趋化因子水平升高、Lgr5水平降低以及Wnt/b-Catenin通路基因失调。这些结果表明，Dclk1在调节结肠炎症反应和结肠上皮完整性方面发挥着重要作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：CW Houchen是COARE Biotechnology，Inc.的创始人。其他作者已声明，不存在任何竞争利益。这不会改变作者对PLOS ONE数据和材料共享政策的遵守。

数字

**图1。正常条件下肠上皮Dclk1缺失的特征。**
**答：。**在Villin的结肠上皮中没有检测到Dclk1^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}老鼠。正常条件下（放大200倍）用抗Dclk1抗体（棕色）染色的结肠组织。B类Dclk1 mRNA水平在绒毛中显著降低^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}老鼠；C类Dclk1和TJPs在Dclk1中的表达水平^上下和Villin^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}老鼠；D类Villin的肠粘膜完整性受损^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}老鼠。灌胃后4 h测定每只小鼠血清中的FITC-葡聚糖水平（每组n=3，*p<0.02）。

**图2。DSS治疗后，Dclk1缺失会加重结肠屏障功能障碍。**
A类.实验方案；B类H&E染色显示Villin组织学正常^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}和Dclk1^{飞行/飞行}小鼠在基线检查时，经DSS治疗（放大200倍）后证实有显著炎症反应C类Western blot分析紧密连接和粘附连接蛋白显示绒毛中Claudin-1、Claudin-7和E-cadherin减少^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}DSS处理后的小鼠；D。在基线和DSS治疗后灌胃4h后，测定每只小鼠血清中的FITC-葡聚糖水平（DSS后组n=5，*p<0.02，***p<0.0001 Villin^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}与Dclk1^{飞行/飞行});E类.绒毛膜中FITC-Dextran水平的折叠变化^Cre公司；数据链1^上下DSS治疗后的小鼠。

**图3。DSS治疗后，Dclk1的缺失增加了上皮细胞凋亡并减少了上皮细胞增殖。**
**答：。**TUNEL法鉴定凋亡细胞（绿色）；B。用抗Ki67抗体免疫染色鉴定增殖细胞。

**图4。上皮Dclk1的缺失加剧了DSS诱导的结肠粘膜炎症。**
**答：。**Villin的结肠MPO活性显著增加^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}DSS处理后的小鼠；B类用实时定量RT-PCR测定结肠组织中Ptgs2、Il6、Il1β、Cxcl1和Cxcl2的mRNA表达水平，并与β-actin进行归一化。条形图中的值表示为平均值±SEM，*p<0.02，****p<0.0001 Villin^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}与Dclk1^{飞行/飞行}；C类Western blotting分析结肠组织中RelA的蛋白表达水平。

**图5。DSS治疗后，Dclk1的缺失增加NF-κB的表达。**
通过抗p65抗体免疫染色鉴定NF-κB p65（Brown）的表达。Villin的箭头显示了p65偶尔的核定位^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}老鼠。阿尔西安蓝用于复染。

**图6。DSS治疗后，Dclk1上皮缺失上调促炎细胞因子和趋化因子。**
**答：。**Bio-Plex Pro小鼠细胞因子23-Plex分析结果的热图。B类结构细胞因子、IL-1α、IL-1β、IL-10和IL17的个体表达水平。C类趋化因子Cxcl1、Ccl2、Ccl3和Ccl5的个体表达水平。

**图7。Dclk1上皮缺失增加DSS诱导的结肠炎后的疾病活动。**
两个维尔林^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}和Dclk1^{飞行/飞行}用3%的DSS饮用水喂养小鼠9天，然后定期饮用水喂养2天，诱导小鼠结肠炎（每组8只）。**答：。**体重。B类.腹泻评分。C类.粪便血分数。D类疾病活动指数。E类.Kaplan-Meier生存曲线（虚线=Villin^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}，实线=Dclk1^{飞行/飞行}). 数据表示为平均值±S.E.M.*p<0.05 Villin^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}与Dclk1^{飞行/飞行}.

**图8。上皮细胞Dclk1的缺失会改变肠簇和干细胞特征。**
从结肠组织中分离出总RNA。Dclk1、Ptgs1、Lgr5和Bmi1的mRNA表达水平(**A、 B、C、D**)通过定量实时RT-PCR进行测量，并与β-肌动蛋白标准化（虚线条=维林^克里；Dclk1型^上下，开条=Dclk1^{飞行/飞行}). 条形图中的值以平均值±SEM表示，*、**、***、***表示统计显著性差异(第页分别<0.05、<0.005、<0.0005、0.00005）。E类DSS治疗后用抗Lgr5和抗Bmi1抗体（棕色）对结肠组织进行染色。F类使用小鼠Wnt/b-Catenin调节cDNA平板阵列测定小鼠Wnt/b Catenin调节基因在结肠组织中的表达水平。

**图9。DSS治疗后结肠组织中β-连环蛋白的免疫组织化学染色。**
β-连环蛋白（Brown）的表达通过抗β-连环素抗体的免疫染色鉴定。在Villin中发现β-连环蛋白的表达增加和核定位增加^Cre公司；数据链1^{飞行/飞行}相对于Dclk1^{飞行/飞行}老鼠。阿尔西安蓝用于复染。

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