跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2015年9月25日；290(39):23563-78.
doi:10.1074/jbc。M115.648774。 Epub 2015年8月7日。

一种新的真菌二萜诱导Bax/Bak缺陷细胞VDAC1依赖性凋亡

李黄 1, 韩俊杰 2, 丹亚·本·哈伊 3, 何鲁伟（Luwei He） 2, 李宝伟 1, 陈子恒 1, 王月莹 1, 杨燕蕾（Yanlei Yang） 1, 刘雷（Lei Liu） 1, 朱玉山 4, 瓦尔达·肖珊·巴马茨 5, 刘洪伟 6, 全晨 7
附属公司

一种新的真菌二萜诱导Bax/Bak缺陷细胞VDAC1依赖性凋亡

李黄等。 生物化学杂志. .

摘要

促凋亡的Bax和Bak蛋白被认为是细胞凋亡的核心，但细胞凋亡是在它们不存在的情况下发生的。在这里，我们询问线粒体蛋白VDAC1是否独立于Bax/Bak介导细胞凋亡。在筛选真菌次级代谢产物库中诱导Bax/Bak缺乏小鼠胚胎成纤维细胞凋亡的化合物后，我们确定了cyathin-R，这是一种新的cyathane二萜化合物，能够通过促进VDAC1齐聚作用激活细胞色素c释放，从而在Bax/Back缺乏的情况下激活细胞凋亡。二苯胺-2-羧酸是VDAC1电导和齐聚的抑制剂，可抑制胱硫蛋白R诱导的VDAC1齐聚和凋亡。同样，Bcl-2的过度表达导致对胱氨酸R诱导的凋亡和VDAC1齐聚产生抵抗。沉默VDAC1表达可阻止胱硫蛋白R诱导的细胞凋亡。最后，cyathin-R有效地抑制了植入异种移植小鼠模型的Bax/Bak缺陷细胞的肿瘤生长并诱导其凋亡。因此，本研究确定了一种促进VDAC1依赖性凋亡的新化合物，作为缺乏或呈现失活Bax/Bak的癌细胞的潜在治疗选择。

关键词：B细胞淋巴瘤2型（Bcl-2）；Bax；Bcl2；川烷二萜；线粒体凋亡；齐聚；蛋白质交联；电压依赖性阴离子通道（VDAC）。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
VDAC1相关凋亡诱导剂的筛选及cyathin-R的结构分析。 A类，复合筛选策略图。B类，DpC降低VDAC1通道电导。如“实验程序”所述，将VDAC1重组为平面脂质双层。在添加DpC（100μ米).C类，VDAC1电导是电压的函数，从60到−60 mV(●) 以及之后(○) 添加DpC。给定电压下的平均稳态电导(克)归一化为10 mV时的最大电导(克0).D类，DpC抑制亚硒酸盐（30μ米，3小时）。使用基于EGS的交联和使用抗VDAC1抗体的免疫印迹显示VDAC1齐聚。E类，Bax−/−/贝克−/−MEF用0.5 m预处理米DpC培养1小时，并与所示化合物（10μ米X15-1、S3、5μ米H8-5和1μ米PAO）。采用annexin-V/PI染色和流式细胞仪分析凋亡细胞死亡情况。平均值±S.E(误差条) (n个=3）。H8-5型，胱硫蛋白-R。F类和克，巴克斯−/−/贝克−/−MEF用cyathin-R处理指定时间，用annexin-V/PI染色，并用流式细胞仪进行分析。三个独立实验之一的数据显示在左边.平均值±S.E(n个=3）。H–J型，胱硫蛋白R的化学结构(H（H）)，关键异核多键关联(HMBC公司)胱硫蛋白-R的(我)以及能量最小的胱硫蛋白R的构象(J型)如图所示。这个箭头显示NOE相关性。MTT公司，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物*，第页< 0.05; ***,第页< 0.001.
图2。
图2。
胱氨酸R诱导Bax细胞凋亡−/−/贝克−/−MEF公司。 A类，细胞色素c（c）线粒体释放；Bax公司−/−/贝克−/−用3μ处理的MEF米cyathin-R在指定时间内的表达，如使用抗细胞色素的免疫组织化学分析c（c）抗体，细胞核用DAPI染色，线粒体用MitoTracker染色。通过共焦显微镜观察细胞。这个放大的图像上正确的来自装箱区域。比例尺，20微米。B类，细胞色素c（c）(细胞c)通过细胞溶质和线粒体部分的免疫印迹分析释放。C类，聚（ADP-核糖）聚合酶(PARP项目)解理；Bax公司−/−/贝克−/−用3μ米cyathin-R用于指定时间。用免疫印迹法分析聚ADP-核糖聚合酶裂解。D类caspase激活；Bax公司−/−/贝克−/−MEF的处理如图1图例所示克然后用CaspACE-FITC-conjugated caspase标记物染色。平均值±S.E(误差条) (n个=3）。E类casapse抑制剂抑制细胞凋亡；Bax公司−/−/贝克−/−MEF用Z-VAD-fmk半胱天冬氨酸抑制剂预处理（1 h），然后用胱氨酸R（5μ米，24小时）。采用annexin-V/PI染色和流式细胞术分析细胞死亡情况。平均值±S.E(n个=3）。F类，细胞核分裂；Bax公司−/−/贝克−/−用3μ米cyathin-R，Hoechst 33342染色，共焦显微镜成像。比例尺，20微米**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001.
图3。
图3。
胱氨酸R诱导Bax细胞凋亡−/−HCT116细胞。 A类和B类，Bax−/−用指定浓度的胱硫蛋白R处理HCT116细胞24小时，收获并分成两部分。一部分用annexin-V/PI染色，另一部分用CaspACE-FITC结合的caspase标记染色。用流式细胞仪对两组人群进行分析。三个独立实验之一的数据显示在左边.平均值±S.E(误差条) (n个=3）。C类，Bax−/−HCT116细胞在指定浓度下用Z-VAD-fmk-caspase抑制剂预处理1h，然后用cyathin-R孵育24h。细胞用annexin-V-FITC和PI染色，并用流式细胞仪进行分析。平均值±S.E(n个=3）。D类，cyathin-R对线粒体膜电位的影响。Bax公司−/−用指定浓度的胱硫蛋白-R处理HCT116细胞（6 h）。在37°C下用TMRM染色10分钟后，用流式细胞仪分析细胞。平均值±S.E(n个=3）。催化裂化装置，羰基氰化物第页-三氟甲氧基苯腙**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001.
图4。
图4。
VDAC1相互作用分子而非环孢霉素A抑制胱硫蛋白R诱导的细胞凋亡。如有指示，通过膜联蛋白-V/PI染色和流式细胞术分析细胞凋亡。A类和B类，Bax−/−/贝克−/−MEF公司(A类)和Bax−/−HCT116结肠癌细胞(B类)用0.5 m预处理米指定浓度的DpC、DIDS、DNDS或SITS（1 h），与胱氨酸R（5μ米24h），并进行细胞凋亡分析。平均值±S.E(误差条) (n个=3）。C类和D类，Bax−/−/贝克−/−MEF公司(C类)或Bax−/−HCT116结肠癌细胞(D类)用环孢素A预处理(环孢素A)在指示浓度下，用5μ米并分析细胞凋亡。平均值±S.E(n个=3）。E类cyathin-R降低VDAC1通道电导。如“实验程序”所述，将VDAC1重组为平面脂质双层。在添加胱硫蛋白-R（5μ米).F类，VDAC1电导是电压的函数，从60到−60 mV(●) 以及之后(○) cyathin-R的添加。给定电压下的平均稳态电导(克)归一化为10 mV时的最大电导(克0).克和H（H）cyathin-R对mPTP的影响。按照“实验程序”中的描述对PTP开放度进行分析。cyathin-R（5μ米)mPTP不在时打开(克)或钙的存在2+（50μ米) (H（H）)通过520 nm处的吸光度变化进行监测，每15–20秒用Ultraspec 2100分光光度计进行监测。**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001.
图5。
图5。
胱氨酸R提高VDAC1水平和寡聚化，并诱导细胞凋亡。 A–D，Bax−/−/巴克−/−MEF公司(A类)和Bax−/−HCT116型(B类)在指定时间用胱氨酸R或Bax治疗−/−/贝克−/−MEF用0.5 m预处理1 h米DpC公司(C类)、SITS、DIDS或DNDS(D类)与胱氨酸R孵育，然后与EGS交联。通过免疫印迹分析VDAC1水平和寡聚化箭头在里面A类表明VDAC1表达水平增加。E类BRET2检测cyathin-R诱导的VDAC1齐聚。Bax公司−/−/贝克−/−MEF与人类VDAC1编码（50 n）特异的siRNA共同转染米)、rVDAC1-Rluc-encoding（0.2μg）和rVDAC1-GFP2-encoding（0.8μg）质粒。作为对照，用VDAC1-Rluc编码质粒和hVDAC1的siRNA共同转染细胞。20小时后，用cyathin-R（3或5μ米，24小时）或使用相关数量的二甲基亚砜。转染48小时后测量荧光素酶和GFP信号。生物发光共振能量传递比(布雷特)按照描述计算信号。在添加底物深蓝C作为发光物质后测量荧光素酶活性，而在510 nm处测量GFP荧光。所有读数均使用Infinite 200 ELISA阅读器进行。F类和克，巴克斯−/−/贝克−/−MEF用5μ米胱氨酸R和亲环素D(Cyp D（气缸D）)Western blotting分析VDAC1水平。VDAC1水平的定量分析显示为增加-倍。H（H），Bax−/−将稳定表达人VDAC1-shRNA的HCT116细胞与cyathin-R（5μ米24h）并进行凋亡分析。平均值±S.E(误差条) (n个=3）。我和J型，稳定的人类VDAC1敲除Bax−/−HCT116细胞转染表达天然或L277R突变大鼠VDAC1。20小时后，用5μ米cyathin-R.通过Western blotting分析等分样品的VDAC1水平和齐聚作用(我). 通过annexin-V/PI染色分析第二组细胞小份(J型). 平均值±S.E(n个=3）。*，第页< 0.05.
图6。
图6。
Cyathin-R诱导的VDAC1寡聚化和细胞凋亡伴随着细胞间Ca的升高2+和被BAPTA-AM抑制。 A类，代表性的[Ca流式细胞术分析2+]我水平，使用Fluo-4监测。Bax公司−/−/贝克−/−MEF细胞与cyathin-R（8μ米)和细胞内钙2+对水平进行评估。所示值表明[Ca增加2+]我.B类，[Ca的定量分析2+]我水平(黑色圆圈)和细胞凋亡(白色圆圈)采用膜联蛋白-V-FITC和PI染色进行分析，并通过流式细胞仪进行分析。C–E类，Bax−/−/贝克−/−MEF细胞与BAPTA-AM（5μ米，1.5小时），然后加入或不加入cyathin-R（5或8μ米和VDAC1过度表达(C类)，VDAC1齐聚(D类)和凋亡(E类)进行了化验。平均值±S.E(误差条) (n个=3）。
图7。
图7。
胱氨酸R通过氧化应激诱导细胞凋亡。 A–E，Bax−/−/巴克−/−MEF用NAC预处理（1 h），然后用cyathin-R（5μ米，16小时）(A类). 用MitoSOX红ROS指示剂对细胞进行染色，并用流式细胞仪进行分析。所示为平均值±S.E(误差条) (n个= 3).B类，细胞与胱氨酸R孵育（6 h），h染色2DCFDA公司(贴现现金流)流式细胞仪分析。所示为平均值±S.E(n个= 3).C类，用cyathin-R（5μ米36 h），annexin-V/PI染色分析细胞凋亡。平均值±S.E(n个＝3）。D类细胞与胱硫蛋白R孵育1h，EGS交联，免疫印迹分析VDAC1寡聚化。E类细胞与胱硫蛋白R孵育（16 h），并使用GSH和GSSG检测试剂盒检测GSH含量。平均值±S.E(n个=3）。F类，Bax−/−/贝克−/−用谷胱甘肽乙酯预处理MEF(GSHee公司)持续1h，然后用cyathin-R（16h）进行细胞凋亡分析。平均值±S.E(n个=3）。克线粒体膜电位（ψ）分析米). Bax公司−/−/贝克−/−用cyathin-R（5μ米，6 h）或羰基氰化物第页-三氟甲氧基苯腙（10μ米6 h）作为阳性对照，与TMRM（10 min，37°C）孵育，流式细胞仪分析荧光。结果显示为减去羰基氰化物测量值后得到的结果第页-三氟甲氧基苯腙(催化裂化装置)控制。平均值±S.E(n个=3）。**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001.
图8。
图8。
DTT可防止胱氨酸R诱导的细胞凋亡和NF-κB的激活。 A类，Bax−/−/贝克−/−MEF用指定浓度的DTT预处理1 h，然后用胱硫蛋白R（3μ米). 采用annexin-V/PI染色和流式细胞术分析细胞死亡情况。平均值±S.E(误差条) (n个=3）。B类和C类，Bax−/−/贝克−/−用cyathrin R（3μ米)在NAC缺席和在场的情况下，在指定时间内（10 m米). 免疫荧光分析显示p65主要存在于胞质溶胶中，尽管cyathrin-R诱导p65易位至细胞核(B类,箭头). 对细胞核部分的分析进一步表明p65易位到细胞核(C类). 当NAC存在时，这种易位被阻止(B类和C类).
图9。
图9。
胱氨酸R通过诱导永生化Bax细胞凋亡抑制肿瘤生长−/−/贝克−/−细胞和Bax−/−异种小鼠模型中的HCT116或HCT116结肠癌细胞。将Bax植入免疫缺陷裸鼠体内−/−/巴克−/−MEF公司(A–D)，Bax−/−HCT116型(E–G公司)，或HCT116(I–J型)结肠癌细胞。一周后，将小鼠分为三组（6只/组），用溶媒对照（DMSO，10%）或胱硫蛋白-R（5或10 mg/kg/2天）进行腹腔内治疗2周，在此期间测量肿瘤大小。cyathin-R治疗两周后，对小鼠实施安乐死，并切除异种移植物进行进一步研究。肿瘤体积曲线(A类,E类，以及H（H）)和孤立肿瘤的代表性图像(B类,F类，以及我)以及治疗2周后裸鼠的平均体重(D类,克，以及J型)如图所示。C类，荧光图像显示凋亡Bax染色−/−/贝克−/−单元格就地TUNEL分析。比例尺，100微米。误差线，同上。
图10。
图10。
Bcl-2调节cyathin-R诱导的VDAC1齐聚和凋亡。 A–C，Bax−/−/贝克−/−MEF用3μ米cyathin-R用于指示时间，并通过免疫印迹分析指示蛋白。A类，细胞被分为线粒体和细胞质组分，Bcl-2通过免疫印迹分析，肌动蛋白和Tim23作为输入对照(B类). 通过实时定量PCR监测Bcl-2 mRNA水平(C类). 平均值±S.E(误差条) (n个＝3）。D类，将FLAG标记的Bcl-2载体转染到Bax−/−使用嘌呤霉素获得HCT116细胞和稳定的Bcl-2过表达细胞。稳定的Bcl-2过度表达Bax−/−HCT116和对照细胞用cyathin-R（5μ米24h）并进行凋亡分析。平均值±S.E(n个=3）。E类，提出了cyathin-R诱导细胞凋亡的模型。胱氨酸R通过触发氧化应激，导致VDAC1水平升高，进而将平衡转移到VDAC1寡聚化，允许细胞色素c（c）释放，导致细胞凋亡。Bcl-2的减少促进VDAC1的寡聚化，导致细胞凋亡。*，第页< 0.05.
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Kroemer G.、Galluzzi L.、Brenner C.（2007），细胞死亡中的线粒体膜渗透。生理学。版次87，99–163-公共医学
    1. Riedl S.J.、Salvesen G.S.（2007）《凋亡体：细胞死亡的信号平台》。自然修订版分子细胞生物学。8, 405–413-公共医学
    1. Shoshan-Barmatz V.、De Pinto V.、Zweckstetter M.、Raviv Z.、Keinan N.、Arbel N.（2010）VDAC，一种调节细胞生死的多功能线粒体蛋白。Mol.Aspects Med.医学杂志31，227–285-公共医学
    1. Antignani A.，Youle R.J.（2006）Bax和Bak如何导致线粒体外膜的渗透？货币。操作。细胞生物学。18, 685–689-公共医学
    1. Crompton M.（1999）线粒体通透性转换孔及其在细胞死亡中的作用。生物化学。期刊341233-249-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型