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.2016年1月；18(1):80-96.
doi:10.1111/cmi.12485。 Epub 2015年9月2日。

金黄色葡萄球菌不能维持吞噬内溶酶体杀伤，易导致巨噬细胞内细菌持续存在

贾米尔·朱布雷尔 1 2, 莫礼时 1 2, 马丁·贝利 1 2, 西蒙·斯通汉姆 1 2, 西蒙·约翰斯顿 1 2 三, 西蒙·福斯特 2 三, 安德鲁·佩登 4, 罗伯特·C·里德 5, 海伦·M·万豪酒店 1 2, 大卫·H·多克雷尔 1 2 6
附属公司

无法维持对金黄色葡萄球菌的吞噬内溶酶体杀伤，易导致细菌在巨噬细胞中持续存在

贾米尔·朱布雷尔等。 细胞微生物学. 2016年1月.

摘要

巨噬细胞是组织中细菌早期先天反应的关键效应物。吞噬和杀死细菌是细菌清除所必需的相互关联的功能，但当巨噬细胞受到大量主要医疗病原体金黄色葡萄球菌的攻击时，其速率限制步骤尚不清楚。我们发现，当暴露于大量金黄色葡萄球菌接种物（纽曼、SH1000和USA300菌株）时，巨噬细胞的细胞内杀伤能力有限，无法与持续吞噬作用和持续微生物杀伤相匹配。巨噬细胞摄入金黄色葡萄球菌与吞噬作用后细菌活性迅速下降有关。然而，并不是所有的细菌都在吞噬溶酶体中被杀死，我们证明吞噬溶酶体内的酸化程度降低，这与吞噬溶酶体成熟失败和组织蛋白酶D的活化程度降低有关。这导致巨噬细胞中活菌胞内细菌的积聚。我们发现巨噬细胞不能参与凋亡相关的细菌杀伤。含有活菌的Ultittop基质巨噬细胞进行细胞裂解，活菌被释放出来，并可被其他巨噬细胞吸收。我们的研究表明，在小鼠模型中，当杀灭过度时，溶解和再摄取周期会维持一个活的细胞内细菌池，并证明肺泡巨噬细胞内的细胞内持续存在。

关键词：葡萄球菌；抗菌剂；免疫学；微生物-细胞相互作用。

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数字

图1
图1
巨噬细胞受到美国。 金黄色葡萄球菌纽曼证明，在细菌持续攻击后，细胞内杀灭作用耗尽。
  1. 答：。

    分化THP‐1巨噬细胞挑战方案。巨噬细胞受到（B）4、（C）6和（D）16的攻击 h、 和细胞内（IC）杀伤动力学估计，三个单独的实验**第页 < 0.01;

    ***第页 < 0.001，重复测量方差分析（ANOVA），使用Sidak的多重比较对前两个时间点进行测试后比较。

  2. （E）

    前1个阶段通过细胞内杀灭去除的细菌百分比和（F）绝对数量 h后清除细胞外细菌并终止吞噬作用，进行三项单独实验*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001，采用Dunnett后验的单向方差分析与4 小时。

  3. G.公司。

    分化的THP‐1巨噬细胞在IFN‐γ刺激或不刺激的情况下培养，然后用美国。 金黄色葡萄球菌用于6 h、 五个单独的实验***第页 < 0.001，双向方差分析，使用Sidak的多重比较，在每个时间点对对照组和刺激组进行测试后比较。

图2
图2
巨噬细胞继续内化美国。 金黄色葡萄球菌纽曼尽管未能维持细胞内杀伤。A.分化THP‐1巨噬细胞感染野生型的实验方案美国。 金黄色葡萄球菌纽曼（Kan）R（右）+文化）或不带（KanR（右）−培养物）卡那霉素抗性的额外脉冲美国。 金黄色葡萄球菌（菅直人R（右）). （B）5、（C）6或（D）10的初始挑战 h.WT（在KanR（右）+文化） = CFU总计 − CFU菅直人R（右），三个单独的实验***第页 < 0.001，比较第一个Kan和最后一个KanR（右）用Dunnett的多重比较检验进行点、双向方差分析
图3
图3
巨噬细胞流量美国。 金黄色葡萄球菌纽曼对未适当酸化的吞噬溶酶体。A、 B.分化的THP‐1巨噬细胞受到pHrodo标记的攻击美国。 肺炎杆菌内政部 = 5对4 h.然后用庆大霉素处理培养物并保持24小时 h感染后。A.细胞内（IC）荧光（R+）或非荧光（R-）的数量美国。 肺炎杆菌每个单元格。（B） 细胞内R+/R−的百分比美国。 肺炎.C–F.公司。分化的THP‐1巨噬细胞受到pHrodo标记的攻击美国。 金黄色葡萄球菌纽曼菌株MOI = 5代表1.5–6 h（C–D）或4 h后用溶葡萄球菌酶处理48小时 h（E–F）和细胞内（C.和E.）的数量或R+/R−细菌的D和F百分比进行了估算，三个单独的实验重复进行***第页 < .001，双向方差分析，Sidak在每个时间点对R+和R-细菌进行测试后的多重比较。
图4
图4
金黄色葡萄球菌纽曼向内胚体的流动显示出不完全成熟。分化的THP‐1巨噬细胞受到美国。 金黄色葡萄球菌，内政部 = 5.答.共焦显微镜下典型LAMP‐1染色，内含巨噬细胞放大图像。在指定的时间点对培养物进行（A–C）LAMP-1（D–E）LAMP-2或（F–G）LIMP-II染色。通过共聚焦显微镜对具有代表性的A.LAMP-1、（D）LAMP-2和F.LIMP-II进行染色，并在插入物中放大图像。与（B–C）LAMP‐1、（E）LAMP­2和（G）LIMP‐II共定位的每个巨噬细胞的细胞内细菌数量，三到四个单独的实验重复进行*第页 < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001，使用Sidak的后验进行双向方差分析（ANOVA）。H.分化的THP‐1巨噬细胞受到美国。 肺炎杆菌内政部 = 5对6 h、 用庆大霉素治疗，维持24小时 h和与LIMP‐II共定位的细胞内细菌数量估计，三个单独实验重复**第页 < 0.01，使用Sidak的后验进行双向方差分析。I.模拟感染（MI）或美国。 肺炎杆菌（转速），美国。 金黄色葡萄球菌纽曼（NEW）和USA300（JE2）挑战分化的THP‐1细胞8 感染后h用抗组织蛋白酶D（CatD）进行检测，以记录前CatD（非活性）和CatD的活性重链，肌动蛋白用作负荷控制。J.通过密度计测定活化CatD重链相对于总CatD的百分比表达，活性形式上方的数字表示活化百分比，三个实验*第页 < 0.05, **第页 < 0.01，使用Sidak的后验进行双向方差分析。
图5
图5
巨噬细胞在受到美国。 金黄色葡萄球菌需要Newman和持续的巨噬细胞溶解以及细胞内细菌的再摄取来维持细胞内细菌池。分化的THP‐1巨噬细胞被模拟感染（MI）或受到美国。 金黄色葡萄球菌纽曼（一）教学语言 = 0.05，最多48 h.A.以每个场的细胞为单位测量巨噬细胞活力。B.显示凋亡细胞核的巨噬细胞百分比表明发生了凋亡。数据代表三个单独的重复实验*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001，使用Sidak的后测试与每个时间点的模拟感染进行双向方差分析（ANOVA）。C–F。6天后培养细菌 在存在（+）或不存在（−）低剂量溶葡萄球菌素（L）或细胞抑素D（CytD）的情况下。（C） 无溶菌酶的巨噬细胞活力 ± CytD或D.与溶葡萄球菌酶 ± CytD（周期D）*第页 < 0.05英里-升 + CytD与I‐L + 细胞周期D***第页 < 0.001 MI‐L对I‐L，I‐L对MI‐L: + CytD和I-L与I-L + 活细胞内（IC）细菌的CytD E.CFU或每个细胞内细菌的F.数量，三个单独的实验重复进行。
图6
图6
小鼠在低剂量下表现出对细胞内细菌的控制。（A–B）105 的CFU美国。 金黄色葡萄球菌注入小鼠肺部。（A） 肺部CFU和（B）细胞内CFU(IC）支气管肺泡巨噬细胞中的CFU 8、24、48和72 h感染后，n个 = 5.（C–F）向小鼠滴注107 的CFU美国。 金黄色葡萄球菌（C） 支气管肺泡灌洗（D）肺中的中性粒细胞数CFU和支气管肺泡（E）巨噬细胞和（F）中性粒细胞中的IC CFU 24n个 = 8, 48n个 = 8和72 小时n个 = 感染后9例*第页 < 0.05, **第页 < 0.01，采用Dunn多重比较检验进行方差分析。
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