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.2015年8月6日;10(8):e0313246。
doi:10.1371/journal.pone.0133246。 电子收集2015。

天然表观基因组在纯化哺乳动物染色质中的保留

附属公司

天然表观基因组在纯化哺乳动物染色质中的保留

安德烈亚斯·赫伦斯伯格等。 公共科学图书馆一号. .

勘误表in

  • 更正:天然表观基因组保留在纯化哺乳动物染色质中。
    Ehrensberger AH、Franchini DM、East P、George R、Matthews N、Maslen SL、Svejstrup JQ。 Ehrensberger AH等人。 公共科学图书馆一号。2015年10月16日;10(10):e0141250。doi:10.1371/journal.pone.0141250。电子收集2015。 公共科学图书馆一号。2015 PMID:26473727 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

摘要

提出了一种在保留自然表观遗传特征的条件下分离25-250个核小体纤维的天然哺乳动物染色质的方案。该材料几乎完全由组蛋白和DNA组成,符合电子显微镜预期的结构。所有探测到的序列都被保留下来,这表明该材料代表了大多数基因组。DNA甲基化标记和组蛋白标记与体内观察到的模式相似。重要的是,核小体的位置也基本上保持不变,除了在CpG岛上,那里的核小体被发现是不稳定的。讨论了用天然哺乳动物染色质重建生化反应的技术挑战。

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数字

图1
图1。净化程序。
(A) 染色质纯化和体外测定图。从大鼠身上取下肝脏,用于制备细胞核。然后通过MNase消化和蔗糖梯度离心提取染色质。(B) 净化程序流程图。首先离心以富集细胞核,然后用MNase消化以溶解染色质,然后蔗糖梯度离心、透析和浓缩。数量表明DNA大致恢复。有关各个分数和步骤的说明,请参见材料和方法。(C) 蔗糖梯度。蔗糖梯度组分的DNA琼脂糖凝胶。(D) 总长度分布。混合组分的琼脂糖凝胶,如C所示。右侧面板显示片段长度的总分布,通过将信号强度标准化为片段长度计算得出。上轴显示核小体的数量,下轴显示以千碱基为单位的长度。虚线表示碎片的平均长度。(E) 染色质的替代来源。蔗糖组分的琼脂糖凝胶和来自小鼠ES细胞和HeLa细胞制备的材料组分S5的总染色质的电子显微照片。箭头显示单个核小体。
图2
图2。基因组染色质的纯度。
(A) 基因组染色质的银染4–12%SDS-PAGE凝胶,突出显示主要条带。请注意,所有主要带都是组蛋白。(B) 三种不同放大倍数下片段S5基因组染色质单个片段的电子显微照片。箭头表示单个核小体。
图3
图3。DNA序列恢复。
(A) 29个约100 bp基因组区域的相对丰度,通过qPCR相对于组织中的DNA进行量化。所测试的最高丰度序列和最低丰度序列之间的丰度差异显示出来(4.3x)。(B) 定量如A中所示,但对六个基因组区域中的每个区域使用三个10 kb内的引物。同一染色体10kb范围内测试的位点之间的丰度差异最大(2.4x)。(C) 从细胞核或纯化的基因组染色质制备的单核小体的配对测序获得的12号染色体上的序列分布。注意,在细胞核中发现的序列也在纯化材料中发现。另请参见S1图。
图4
图4。组蛋白标记保留。
(A) 各种组蛋白标记、组蛋白变体和核心组蛋白的Western blot表明,纯化后检测到所有标记。关于完整的条带,请参见S2图(B)。比较蛋白质印迹显示,细胞核和纯化基因组染色质中三个组蛋白标记和一个组蛋白变体的水平与组蛋白H3的水平相似。(C) 基因组染色质和组织中三个位点上H3K4me3和H3K27me3的染色质IP。误差条显示了三个生物复制品的标准偏差。相对于TSS的坐标。(D) 基因组染色质中H3K4me3的ChIP-Seq显示了活性基因的预期峰值模式(箭头)。(E) TSS周围D的Metaprofile显示了转录起始点周围H3K4me3的预期峰值。
图5
图5。核小体位置。
一个活性位点启动子上的核小体位置(Gapdh公司)和两个被抑制的基因座(纳克磅5f1)通过ChIP-qPCR对纯化基因组染色质(黑色)和细胞核(红色)的单核小体进行定位。峰高反映核小体占有率,虚线表示核内核小体峰的中心。
图6
图6。DNA甲基化分析。
(A) 组织和纯化基因组染色质基因的亚硫酸氢盐测序分析。提取DNA(组织)或纯化为天然基因组染色质(纯化),并进行亚硫酸氢盐测序分析。黄色、蓝色和白色方框分别表示胞嘧啶的非甲基化、甲基化和未确定状态。(B) A.(C)亚硫酸氢盐测序分析中甲基化的定量血红蛋白II保护试验。从组织中提取或纯化为天然基因组染色质的DNA用甲基化敏感限制性内切酶消化。来自血红蛋白II处理的样品与未消化样品中扩增的DNA的相对数量相关,并以受保护DNA的百分比表示。
图7
图7。纯化过程中富含GC的核小体的损失。
(A) 从细胞核中提取的核小体或从消化成单核小体的纯化基因组染色质中提取的核小体的标准化读取计数,在所有TSS的周围平均。请注意,纯化材料中TSS周围的损耗大于细胞核中的损耗。(B) 纯化后的核小体损失与核小体GC含量有关。从细胞核和纯化的染色质中读取的核小体计数在基因组的500 bp窗口内进行计数。将显示两者的log2比率。灰色线表示拟合的黄土函数,虚线表示平均基因组GC含量为41%。(C) 所有CpG孤岛(CGI)周围平均的标准化读取计数。
图8
图8。PRC2和提取物使基因组染色质甲基化。
染色质与PRC2或全细胞提取物孵育,并且H-SAM,产品在SDS-PAGE凝胶上运行,以进行荧光分析。PRC2将其已知底物组蛋白H3甲基化,而提取组蛋白H3H1的甲基化物。

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