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.2015年8月5日；11（8）：e1005086。
doi:10.1371/journal.ppat.1005086。 eCollection 2015年8月。

一种用于跨内质网膜转运的未开发病毒劫持宿主解聚机制

马杜·苏德汉·拉文德兰 1, Parikshit Bagchi公司 1, 井上孝文 1, 蔡比利（Billy Tsai） 1
附属公司

一种用于跨内质网膜转运的未开发病毒劫持宿主解聚机制

马杜·苏德汉·拉文德兰等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

哺乳动物细胞溶质Hsp110家族与Hsc70:J蛋白复合物一起，起到了解聚机制的作用，以纠正蛋白质错误折叠问题。在这里，我们揭示了这种机制在病毒进入过程中驱动膜移位的新作用。无包膜病毒SV40穿透内质网（ER）膜到达胞浆，这是一个关键的感染步骤。结合生物化学、细胞基础和成像方法，我们发现Hsp110家族成员Hsp105与ER膜J蛋白B14相关。在这里，Hsp105与Hsc70合作，通过分解膜包埋病毒，将穿透膜的SV40提取到细胞质中。因此，Hsc70依赖的Hsp105解聚机制提供的能量可以用于催化膜移位事件。

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数字

图1
图1。细胞溶质Hsp105与ER膜J蛋白B14相互作用
A类用B14免疫印迹法分析293 T-Rex细胞裂解物中Flp-in中B14-3xF和内源性B14的表达。左侧显示了相应的kDa分子量标记。B类B14-3xF从感染SV40 MOI~50（“+”）或未感染（“-”）的293 T-Rex细胞中的Flp-In免疫纯化。结合蛋白用3x FLAG肽洗脱，样品用SDS-PAGE分离，然后进行银染。切除带（如右图所示）并进行质谱分析。凝胶右侧列出了条带的蛋白质身份。C类用所示抗体对（B）中的样品进行免疫印迹。未感染但不表达B14-3xF的HEK 293T细胞作为对照。天CV-1细胞与DSP交联，裂解，内源性B14免疫沉淀，沉淀样品用所示抗体进行免疫印迹。如有指示，细胞感染了SV40。E类表达F-B14或F-B14 H136Q的细胞交联、裂解，FLAG标记蛋白免疫沉淀，然后使用所示抗体进行免疫印迹。F类用对照（ctrl）或Hsc70型siRNA被转染Hsp105型WT-F和FLAG标记蛋白免疫沉淀，然后使用所示抗体进行免疫印迹。G公司与F中一样，除了新加坡旅游局使用siRNA。H（H）CV-1细胞中的S标记蛋白被亲和纯化并使用所指示的抗体进行免疫印迹。
图2
图2。Hsp105对多瘤病毒感染至关重要。
A类CV-1细胞转染了ctrl siRNA，或Hsp105型siRNA#1或#2持续24小时，并用指示的抗体（顶面板）对产生的WCE进行免疫印迹，或进行RT-PCR分析以观察XBP1型拼接（底部面板）。用DTT处理的细胞作为阳性对照。B类将（A）中的细胞感染SV40（MOI~0.5）24 h，固定，并对SV40大T抗原（TAg）进行免疫染色。使用免疫荧光显微镜对感染进行评分（每种情况下计数>1000个细胞）。数据归一化为ctrl siRNA。值表示平均值±SD（n≥3）。C类如（B）所示，除了细胞在BKV-TAg免疫染色前被BKV感染40小时外。天酵母和人类Hsp70和Hsp110家族蛋白质的多序列比对。仅显示相关序列。突出显示的区域表示被改变以产生Hsp105突变体的氨基酸（参见方法）。E类从293T细胞中纯化出F标记蛋白，并用SDS-PAGE分析其纯度，然后用亮蓝R250染色。Hsc70从商业来源获得（见方法）。星号表示抗体重链带。F类将（E）中纯化的蛋白质与ATP结合的糖珠孵育。使用FLAG抗体通过免疫印迹分析未结合和结合蛋白。G公司对表达所示F标记蛋白的CV-1细胞进行免疫沉淀，并对洗脱的样品进行免疫印迹分析。H（H）用薄层色谱法测定在所示纯化蛋白与放射性标记ADP-Hsc70孵育后仍与Hsc70结合的放射性标记ADP的水平。黑线表示从同一胶片上拼接出一条中间车道。我CV-1细胞用ctrl或Hsp105型siRNA#1在转染所示标记构建物24小时前保持24小时。然后用SV40（MOI~0.5）感染细胞24小时，固定并用抗FLAG/S和抗TAg抗体染色。通过免疫荧光显微镜（右图）仅在表达所示标记蛋白的细胞中计算TAg阳性细胞的百分比。数值代表平均值±SD（n≥3）。内源性Hsp105以及转染的Hsp105 WT-F和GFP-F在来自对照细胞和Hsp105缺失细胞的细胞提取物中的蛋白表达水平GFP公司-F或Hsp105型WT-F）如图所示（左侧面板）。免疫印迹中的三条泳道对应于右图中的前三条泳道。
图3
图3。Hsp105对于SV40胞浆的到达是必不可少的。
A类将转染有所示siRNAs的CV-1细胞与SV40（MOI~5）孵育24 h，收获12 hpi，并根据半透性胞浆到达试验进行处理（见方法）。Hsp90和PDI分别作为胞质溶胶和膜部分的标志物。B类对（A）中胞浆部分的相对VP1带强度进行量化。将数据归一化为ctrl siRNA。值表示平均值±SD（n=3）。C类将（A）中的膜部分溶解在含有1%Triton X-100的缓冲液中。离心后，用VP1抗体免疫印迹法分析含有ER-localized SV40的提取材料（顶面板）。ER-localized分数中的相对VP1带强度如（B）所示（底部面板）。天如（A）所示，除了细胞在采集和使用所示抗体分析之前用10 nM霍乱毒素处理90分钟。E类CV-1细胞转染ctrl或Hsp105型siRNA#1。24小时后，用SV40（MOI~20）感染细胞16小时。然后对细胞进行固定、染色，并用免疫荧光显微镜进行分析。实验装置如图左侧所示。插页显示虚线框的2倍放大区域。比例尺，20μm。F类对siRNA转染的细胞进行评分，以确定每个细胞中是否存在至少一个BAP31阳性病灶，并将值归一化为ctrl siRNA。条形图表示平均值±SD（n≥3）**第页<0.01.G公司。通过使用ImageJ软件量化控制和敲除条件下BAP31病灶/细胞的数量，或基于测量面积（以像素为单位）的BAP31灶的大小，进一步评估（F）中的结果*第页<0.05, **第页<0.01***第页<0.001.
图4
图4。Hsp105过表达增强了SV40对细胞液的提取。
A类表达所示S标记结构的COS-7细胞感染了SV40（MOI~5）。12 hpi，如图3A所示处理细胞，并使用所示抗体对样品进行免疫印迹。B类对（A）中细胞溶质放大SV40的VP1带强度进行量化，并与Hsp90带强度进行标准化。数值代表平均值±SD（n≥3）*第页<0.05.C类表达所示F-或S-标记结构的细胞在24 hpi（MOI~0.5）后对TAg表达进行评分，并将数值归一化为GFP。条形图表示平均值±SD（n≥3）。天表达GFP-S或Hsp105 WT-S的CV-1细胞被SV40（MOI~30）感染16 h。细胞被固定，用BAP31和VP1抗体染色，并如图3E所示成像。实验装置如图左侧所示。在第一列中，显示了在不表达该蛋白的细胞中表达GFP-S（顶行）或Hsp105 WT-S（第二行）的代表性细胞。插页显示虚线框的2倍放大区域。比例尺，20μm。E类表达所示标记结构的细胞在每个细胞中至少存在一个BAP31阳性病灶时进行评分，并将数值归一化为GFP。条形图表示平均值±SD（n≥3）。F类.用ctrl或Hsp105型随后用所示的标记构建物转染siRNA#1，BAP31病灶的定量如（E）所示*第页<0.05.
图5
图5。Hsp105参与内质网膜穿透SV40并促进病毒的分解。
A类将图2E中所示的纯化蛋白与DTT/EGTA处理的SV40一起孵育。从样品中免疫沉淀SV40，并使用所示抗体进行免疫印迹分析。B类表达所示S标记蛋白的CV-1细胞感染了SV40（MOI~10）。12hpi，从WCE亲和纯化的S标记蛋白，并用所指示的抗体进行免疫印迹。C类如（B）所示，除了细胞在指定时间内感染SV40。天表达Hsp105 WT-S的细胞被SV40感染12 h，与DSP交联，并分离产生胞浆和膜部分。Hsp105 WT-S从每个组分中亲和性分离，并用所示抗体对样品进行免疫印迹分析。E类如（B）所示，除了所示的F标记结构在细胞中表达外。F类提取Triton X-100，将ER-localized SV40与所示纯化蛋白孵育，并进行不连续蔗糖梯度离心。从梯度顶部收集分数（如图左侧所示），并使用VP1抗体通过免疫印迹分析SV40的存在。
图6
图6。一个模型描述了SV40从内质网到胞浆的Hsp105依赖性提取。
当病毒从细胞表面进入内质网时，SV40感染开始（步骤1）。在内质网中，特异性内质网受体异构酶和还原酶诱导病毒的构象变化，产生疏水颗粒（步骤2）。然后，疏水性病毒与内质网膜结合并整合到内质网中，SV40在内质网内聚集成离散的病灶（步骤3）。我们设想Hsp105通过Hsc70/Hsp70直接或间接锚定在膜结合J蛋白B14上，与膜穿透病毒结合（步骤4a，见插入）。Hsp105-Hsc70结合释放SV40的连续循环启动提取过程，这一步骤可能与膜包埋病毒颗粒的分解相耦合（步骤4b）。当SV40完全释放到细胞液中时，提取完成（步骤4c）。胞浆到达后，部分分解的病毒颗粒中间产物动员到细胞核中以刺激感染（步骤5）。
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