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.2015年7月30日5:52549。
doi:10.1038/srep12549。

三叉神经节神经元Toll样受体4信号通路参与急性牙髓炎大鼠的痛觉感受

贾吉林 1, 一都 2, 蔡文科 三, 荣光 4, 丁昌（Ting Chang） 5, 卓章 5, 杨永祥 5, 朝阳 5, 朱毅力 5, 方匡 6
附属机构

三叉神经节神经元Toll样受体4信号通路参与急性牙髓炎大鼠的痛觉感受

林嘉吉等。 科学代表. .

摘要

急性牙髓炎（AP）引起的疼痛是临床常见症状。然而，其潜在机制在很大程度上仍然未知。使用AP模型，我们证明了牙齿损伤引起严重的牙髓炎症，血清IL-1β上调。通过头牵反射阈值（HWTs）和旷场试验评估，受伤后1天出现了伤害性反应。发现损伤牙髓同侧三叉神经节（TG）Toll样受体4（TLR4）持续上调；TLR4下游信号成分包括MyD88、TRIF和NF-κB，以及细胞因子如TNF-α和IL-1β也增加。逆行标记显示，TG中TLR4阳性神经元大多对牙髓有神经支配作用，TLR4免疫反应主要在中、小神经元。双标记显示同侧TG中TLR4表达神经元TRPV1和CGRP阳性，IB4阴性。此外，通过厄立特里亚（TLR4拮抗剂）阻断AP模型TGs中TLR4，显著下调MyD88、TRIF、NF-κB、TNF-α和IL-1β的生成和伤害性反应行为。我们的研究结果表明，TG细胞中的TLR4信号，尤其是肽能TRPV1神经元，在AP诱导的伤害性反应中起着关键作用，并表明TLR4可能是口腔面部疼痛的潜在治疗靶点。

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数字

图1
图1。牙髓暴露引起的AP炎症和行为改变。
(A类)大鼠AP不同时间点左髓苏木精、伊红染色。（箭头表示坏死组织和正常组织表面的炎性细胞浸润）。SHAM组牙髓正常，无炎症细胞或坏死；AP-1组炎症细胞密集聚集，占据牙髓腔大部分，顶部坏死；在空腔的底部只留下最少量的重要牙髓。在AP-3中，大多数牙髓组织已发展为坏死，腔内几乎没有炎性细胞。（巴 = 100 微米）***P（P） < 0.01; n个 = 每组8个。(B类)酶联免疫吸附试验（ELISA）检测AP大鼠不同时间点的血清IL-1β，结果显示AP-1组的血清IL-1-β较SHAM和AP-3组显著升高。**P（P） < 0.01比SHAM；##P（P） < 0.01比AP-3；n个 = 每组8个。(C类)AP大鼠不同时间点的机械和热重负荷。SHAM组和AP-3组的左右TG无显著差异。AP-1组只有左侧舌的HWT显著降低。**P（P） < 0.01 vs.SHAM组左侧舌；##P（P） < AP-1组与右侧舌的对比为0.01；&&P（P） < AP-1组0.01 vs.左侧舌；n个 = 每组8个。(D类)AP大鼠在不同时间点的野外试验结果。SHAM组和AP-3组之间没有显著差异。与其他组相比，AP-1组的自发活动时间减少，梳理时间和饲养时间显著增加。**P（P） < 0.01比SHAM；##P（P） < 0.01比AP-3；n个 = 每组8个。
图2
图2。AP诱导同侧（左侧）损伤牙髓TG中TLR4表达上调。
(A类)和(B类)定量分析AP大鼠不同时间点TG中TLR4免疫组化标记的代表性图片。SHAM组左右TG无显著差异，所有数据均由SHAM组左TG归一化。与SHAM组的左TG或AP-1组的右TG相比，AP-1组左TG的TLR4免疫反应性显著增强。（巴 = 100 微米）**P（P） < 0.01 vs.SHAM左TG；##P（P） < AP-1中0.01 vs.右侧TG；&&P（P） < 0.01 vs.AP-1左TG；n个 = 每组8个。(C类)以β-肌动蛋白为内标物，对接受AP模型的大鼠TGs样品进行TLR4蛋白定量密度分析的代表性免疫印迹。免疫印迹是从相同实验条件下运行的微凝胶中获得的。SHAM组左右TG无显著性差异；通过SHAM组的左TG对斑点的像素进行归一化，以进行比较。与其他组相比，AP-1组的左侧TG中TLR4蛋白水平显著升高。**P（P） < 0.01 vs.SHAM左TG；##P（P） < 0.01 vs.AP-1右侧TG；&&P（P） < 0.01 vs.AP-1的左TG；n个 = 每组8个。(D类)TGs中TLR4 mRNA表达的图示。SHAM组左右TG无显著差异，所有数据均由SHAM组左TG归一化。与其他组相比，AP-1的左TG显著增加。**P（P） < 0.01 vs.SHAM左TG；##P（P） < 0.01 vs.AP-1右侧TG；&&P（P） < 0.01 vs.AP-1的左TG；n个 = 每组8个。
图3
图3。AP-1.TG中TLR4的免疫荧光染色。
(A类)神经元逆行标记FG和TLR4免疫荧光染色。典型图片显示，左侧和右侧TG中FG标记的神经元数量相似；但是，与右侧TG相比，左侧TG中TLR4免疫染色的神经元数量显著增加。AP-1组中，与右侧TG相比，左TG中也表达TLR4的FG标记神经元数量显著增多。***P（P） < 0.01 vs.AP-1右侧TG；n个 = 每组8个。(B类)和(C类)共聚焦显微镜扫描的AP-1组TGs神经元和卫星细胞TLR4免疫反应性的图像堆栈。AP-1左侧TG神经元TLR4染色显著增强，包括细胞质（B段：Bar = 300 微米；C部分：左：酒吧 = 40 μm，右侧：巴 = 450 微米）。(D类)TLR4阳性神经元直径的测量。54.59 ± 1.19%的神经元为10-20个 微米，35.56 ± 1.49%为20-40岁 μm和9.85 ± 40-60岁的人占1.56% μm，表明TLR4免疫反应大多在中小神经元中，包括细胞质。###P（P） < 0.01; n个 = 每组8个。
图4
图4。TLR4与典型疼痛相关分子的免疫荧光染色。
AP-1组两个TG中TLR4和TRPV1/CGRP/IB4的免疫荧光染色及定量分析。结果表明，与AP-1组的右侧TG相比，左侧TG的TRPV1/CGRP/IB4细胞数量显著增加。双标记染色显示TLR4的表达增加主要在TRPV1或CGRP阳性神经元中，而在AP-1组左侧TG的IB4阳性神经元中没有表达（Bar = 40 微米）。***P（P） < 0.01; n个 = 每组8个。
图5
图5。TLR4下游分子在TGs中的表达。
(A类)和(B类)AP大鼠TGs样本的代表性免疫印迹，以β-肌动蛋白/层粘连蛋白B为内标进行定量密度分析。免疫印迹是从相同实验条件下运行的微凝胶中获得的。SHAM组左右TG无显著差异，用SHAM组左TG对斑点像素进行归一化比较。统计分析表明，与其他组相比，AP-1组左侧TG中MyD88、TRIF和NF-κB（核内）蛋白水平显著升高。**P（P） < 0.01 vs.SHAM左TG；##P（P） < 0.01 vs.AP-1右侧TG；&&P（P） < 0.01相对于AP-1的左TG；n个 = 每组8个。(C类)AP大鼠不同时间点TG中IL-1β和TNF-α的ELISA检测结果：SHAM组左右TG无显著差异，数据经SHAM组左TG归一化。统计分析表明，与其他组相比，AP-1组左侧TG中IL-1β和TNF-α显著升高。**P（P） < 0.01 vs.SHAM左TG；##P（P） < 0.01 vs.AP-1右侧TG；&&P（P） < 0.01 vs.AP-1的左TG；n个 = 每组8个。
图6
图6。厄利托拉对暴露于牙髓后1天的伤害性反应行为的影响。
不同组的旷场试验和HWTs试验结果：与其他组相比，AP-1组左侧TG的伤害性反应显著增加，而厄立特里亚或布洛芬给药可以缓解这种伤害性反应。服用厄立特里亚或布洛芬后，活动时间显著增加，而梳理时间在AP-1中下调 + E组与AP-1组比较。AP-1的饲养时间也增加了 + E和AP-1 + I组与AP-1组进行比较。AP-1组同侧舌对受损牙髓进行机械和热刺激时的HWT水平显著高于对照组 + E/AP-1 + I组比AP-1组，而AP-1和AP-1之间没有差异 + V组。**P（P） < 0.01比SHAM；##P（P） < 0.01比AP-1；n个 = 每组8个。
图7
图7。厄立特里亚对左TG中TLR4下游分子表达的影响。
(A类)和(B类)用β-肌动蛋白/层粘连蛋白B作为内标物进行定量密度分析的不同组左侧TGs样本的代表性免疫印迹。免疫印迹是从相同实验条件下运行的微凝胶中获得的。SHAM组左右TG无显著差异，用SHAM组左TG对斑点像素进行归一化比较。与其他组相比，AP-1组左侧TG中MyD88、TRIF和NF-κB（核内）蛋白水平显著升高，这些蛋白被厄立特里亚解救。**P（P） < 0.01比SHAM；##P（P） < 0.01比AP-1；n个 = 每组8个。(C类)ELISA法检测不同组左TG中IL-1β和TNF-α的含量。与其他组相比，经厄立特里亚解救的AP-1大鼠的左侧TG显著增加。**P（P） < 0.01比SHAM；##P（P） < 0.01比AP-1；n个 = 每组8个。
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