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.2015年11月；13(11):1509-19.
doi:10.1158/1541-7786.MCR-15-0204。 Epub 2015年7月29日。

钙三醇靶向LRP6抑制胰腺癌Wnt信号转导

迈克尔·D·阿伦斯曼 1, 菲利普·阮 1, 凯萨琳·M·克肖 1, 安娜·R·雷 1, 克莱尔·奥斯特塔格-希尔 1, 玛拉·谢尔曼 2, 迈克尔·唐斯 2, 克里斯托弗·利德尔 三, 罗纳德·M·埃文斯 4, 大卫·W·道森 5
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钙三醇靶向LRP6抑制胰腺癌Wnt信号转导

迈克尔·D·阿伦斯曼等。 摩尔癌症研究. 2015年11月.

摘要

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种侵袭性恶性肿瘤，需要更有效的治疗方法。Wnt/β-catenin信号通路是一个潜在的治疗靶点，在PDAC肿瘤的发生和发展中起重要作用。维生素D是具有合适体内生物活性的Wnt抑制剂之一，已知其可拮抗结直肠癌中Wnt/β-catenin信号传导，并在PDAC中具有抗肿瘤活性。在本研究中，通过使用钙泊三醇（一种有效的非高钙血症维生素D类似物）来研究维生素D信号、Wnt/β-catenin活性和PDAC肿瘤细胞生长之间的关系。钙泊三醇抑制PDAC肿瘤细胞生长与维生素D受体表达和Wnt/β-catenin活性呈正相关。此外，发现维生素D和Wnt信号活性通过反馈调节相互关联。钙三醇抑制PDAC细胞系自分泌Wnt/β-catenin信号，同时降低低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）的蛋白水平，LRP6是配体依赖性典型Wnt信号的必要辅受体。钙泊三醇降低LRP6蛋白是通过一种新的机制介导的，该机制涉及低密度脂蛋白受体适配器蛋白1（LDLRAP1）的转录上调。最后，LRP6或LDLRAP1表达的变化直接改变了Wnt报告基因的活性，支持它们作为配体依赖性Wnt/β-catenin信号传导的调节因子的作用。

启示：本研究提供了一个新的生化靶点，维生素D信号通过该靶点对Wnt/β-catenin信号产生抑制作用，以及潜在的生物标记物，用于预测和跟踪肿瘤对维生素D治疗的反应。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
钙泊三醇抑制胰腺癌生长与VDR表达水平和自分泌Wnt/β-catenin信号相关。（A） 与对照Renilla和BAR-核糖核酸酶或fuBAR-荧光素酶报告基因共转染PDAC细胞株48小时后，通过BAR/fuBAR比值和双荧光素素酶分析测定VDR和微管蛋白（负荷对照）和平均Wnt报告活性的Western blot(n个=3个生物复制品）。（B） MTT生长分析（72小时测量）和（C）钙泊三醇指示浓度下软琼脂集落形成。还显示了AsPC-1软琼脂集落形成的代表性图像。数据仅归一化为载具，并报告为平均值±标准偏差（SD），显示了3-5个生物重复的一个代表性实验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图2
图2
钙泊三醇通过VDR介导Wnt信号传导的抑制。（A） 24小时在具有稳定BAR-核糖核酸酶报告子的AsPC-1细胞中测得的钙泊三醇对Wnt信号的剂量-反应曲线。（B）AXIN2型用载体或100 nM（AsPC-1）、5μM（YAPC）或1μM（HPAF-2和Suit2）钙泊三醇治疗24小时后用qPCR测定表达。（C） 转染对照或VDR siRNA的AsPC-1的VDR、LRP6和微管蛋白（负荷对照）western blots和（D）BAR-核糖核酸酶活性48小时，并用载体或100 nM钙泊三醇额外处理24小时。所有值均归一化为相应的对照，BAR报告为平均值±SD，qPCR报告为平均数±SEM。显示了至少三个生物重复的一个代表性实验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图3
图3
钙三醇治疗降低PDAC中LRP6的表达。在细胞系用载体或100 nM（AsPC-1）、5μM（YAPC）或1μM（HPAF-2和Suit2）钙泊三醇处理后的指定时间点，在全细胞裂解液上进行LRP6或微管蛋白（负荷控制）的（A-B）Western blot。（C） 用全长LRP6表达载体或对照GFP载体转染AsPC-1 48小时，并用载体或100 nM钙泊三醇进一步处理24小时后测量其BAR-淀粉酶活性。（D） 对照或串联后AsPC-1全细胞裂解产物上的RXRα、RXRβ、LRP6和微管蛋白蛋白印迹RXRA和RXRBsiRNA转染48小时，然后用载体或100 nM钙泊三醇进一步治疗24小时。（E-F）轻轨6号线100 nM钙泊三醇治疗指定时间后，通过qPCR测定基因表达。在钙泊三醇治疗之前，通过血清饥饿使细胞同步化。所有值均归一化为相应的对照，BAR报告为平均值±SD，qPCR报告为平均数±SEM。显示了2-3个生物重复的一个代表性实验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001,纳秒=不重要。
图4
图4
钙三醇诱导LDLRAP1系统调节LRP6蛋白水平。（A） 用载体或100 nM钙泊三醇处理AsPC-1细胞2或6小时后，来自RNA-seq的选定基因的热图。（B） AsPC-1细胞经载体、100 nM钙化三醇、100 nM-Bafilomycin A1或两者的组合处理6小时后，对LC3B、LRP6和微管蛋白（负荷控制）进行Western blot。（C）LDLRAP1系统在图3E所述的处理后通过qPCR表达。（D） LDLRAP1、LRP6和微管蛋白的Western blot（负载控制）。用对照或LDLRAP1 siRNA转染AsPC-1细胞48小时，然后用载体或100 nM钙泊三醇处理24小时。在相应的印迹下显示了标准化为微管蛋白负载对照的LDLRAP1和LRP6表达的相对密度测定值。（E） AsPC-1细胞中的BAR-淀粉酶活性如（D）所述。数值按各自的对照标准化显示，BAR报告为平均值±SD，qPCR报告为平均数±SEM。显示了3个生物重复的一个代表性实验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
图5
图5
PDAC中的VDR由Wnt信号调节。（A） 基因集富集分析（27）PDAC特异性Wnt/β-catenin靶基因集的富集图，该富集图使用25个原发性PDAC肿瘤样本的已发表基因表达微阵列数据集相对于VDR表达表型确定。顶部曲线显示目标基因集的连续富集分数，而中间部分显示VDR表达的热图（红色-高，蓝色-低），底部显示基因列表中排名指标的值。（B） BAR荧光素酶活性和视频数据记录器转染带有对照或WNT7B siRNA的AsPC-1细胞后48小时qPCR48表达。（C）BAR荧光素酶活性和视频数据记录器用载体或5μM CHIR99021（CHIR）处理指定PDAC细胞株24小时后通过qPCR表达。数值按各自的对照标准化显示，BAR报告为平均值±SD，qPCR报告为平均数±SEM。显示了3个生物重复的一个代表性实验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.
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