Genomic analysis reveals distinct mechanisms and functional classes of SOX10-regulated genes in melanocytes

doi:10.1093/hmg/ddv267

.2015年10月1日；24(19):5433-50.

doi:10.1093/hmg/ddv267。 Epub 2015年7月23日。

基因组分析揭示了黑素细胞中SOX10调节基因的不同机制和功能类别

附属公司

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家人类基因组研究所遗传病研究分所，邮编：20892。
²美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编21205。
^三美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家人类基因组研究所计算和统计基因组学分所，邮编：20892。
⁴杜克大学基因组和计算生物学中心，美国北卡罗来纳州达勒姆，邮编27708。
⁵伦敦大学圣乔治分校分子细胞科学研究中心，英国伦敦SW17 0RE。
⁶美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家人类基因组研究所遗传病研究分所，邮编：20892，bpavan@mail.nih.gov。

PMID： 26206884
预防性维修识别码：项目经理4572067
内政部： 10.1093/hmg/ddv267

基因组分析揭示了黑素细胞中SOX10调节基因的不同机制和功能类别

Temesgen D Fufa公司等。人类分子遗传学. 2015.

.2015年10月1日；24(19):5433-50.

doi:10.1093/hmg/ddv267。 Epub 2015年7月23日。

附属公司

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家人类基因组研究所遗传病研究分所，邮编：20892。
²美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编21205。
^三美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家人类基因组研究所计算和统计基因组学分所，邮编：20892。
⁴杜克大学基因组和计算生物学中心，美国北卡罗来纳州达勒姆，邮编27708。
⁵伦敦大学圣乔治分校分子细胞科学研究中心，英国伦敦SW17 0RE。
⁶美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家人类基因组研究所遗传病研究分所，邮编：20892，bpavan@mail.nih.gov。

PMID： 26206884
预防性维修识别码：项目经理4572067
内政部： 10.1093/hmg/ddv267

摘要

SOX10是黑素细胞发育和维持所必需的，并且与黑色素瘤的发生和发展有关。然而，SOX10指导促进黑素细胞谱系所需的适当基因表达程序的分子机制尚不完全清楚。在这里，我们采用遗传和表观基因组分析方法来揭示SOX10在黑素细胞中的新的基因组靶点和以前未被认可的分子作用。通过对SOX10-结合位点和染色质状态的表观遗传特征的全局分析，我们揭示了全基因组范围内SOX10靶点的广泛目录。我们的研究结果表明，SOX10主要参与“开放”染色质区域，并与远端调控元件结合，包括新的和以前已知的黑素细胞增强子。综合染色质占有率和转录组分析表明，SOX10在转录激活和抑制中发挥作用，以调节功能不同的基因类别。我们证明，不同的表观遗传特征和预测结合假定共同调控转录因子的顺调控序列基序定义了SOX10-活化和SOX10--表达的靶基因。总的来说，这些发现揭示了SOX10作为黑素细胞谱系中基因表达的全球调节器，通过靶向不同的调节途径发挥的中心作用。

牛津大学出版社2015年出版。本作品由（a）美国政府雇员撰写，在美国属于公共领域。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
SOX10和KIT在黑素细胞中的表达呈负相关。(A类)定量RT-PCRSox10型和*配套元件*melan-a（对照）和*Sox10型^LacZ公司/+*黑素细胞系显示*Sox10型*表达，并且在*配套元件*基因表达与*Sox10型*单倍充足。误差条表示目标和内源性控制表达值的方差系数校正的折合变化的标准偏差。(B类)KIT蛋白的免疫标记*在体外*显示该选择*Sox10型^LacZ公司/+*细胞表现出KIT阳性表达（绿色），这在对照的melan-a细胞中不明显。单个细胞通过SOX10（红色）核染色显示。(C类)出生后第2天野生型C57BL/6J小鼠毛囊中KIT蛋白的免疫标记表明，黑素细胞干细胞（箭头）显示高KIT荧光强度（绿色），而毛球黑素细胞（箭头型）产生低KIT荧光密度。毛囊由白色虚线勾勒出来，通过对黑素细胞标记物DCT（红色）的阳性染色，在右侧面板中可以看到黑素细胞干细胞和黑素细胞。(D类–**G公司**)野生型中期生长毛囊中黑素细胞标记物DCT（红色）和KIT（绿色）的双重免疫标记，Tg（DCT-Sox10）/0，*Sox10型^LacZ公司/+*和*配套元件^LacZ公司/+*成年小鼠的毛球黑素细胞内KIT荧光强度根据基因型表现出变异性。红色虚线标记阳性DCT染色的边界，并指示用于计算毛球黑素细胞内KIT荧光像素强度的ROI(**H（H）**). 毛囊鳞茎由白色虚线勾勒出来。（H） DCT显示的KIT平均每像素荧光强度的方框图和晶须图⁺毛球黑素细胞由单个ROI定义（误差条表示最小值到最大值，方框定义第25-75个百分位，线条标记中位数）。ROI示例由（D–G）中的红色虚线表示。每个基因型至少评估了125个ROI，并通过Kolmogorov–Smirnov检验确定了统计显著性(**P（P）*<0.0001）。(我)MITF平均数的量化⁺用于计算（H）中KIT荧光强度的ROI中包含的细胞核表明，不同基因型的每个ROI中观察到的细胞核数量相似。误差条表示标准偏差。(J型)毛球黑素细胞的免疫标记显示他莫昔芬诱导*Sox10型*成年人击倒*Sox10型^{飞行/飞行}*;Tyr:：CreERT2小鼠产生大量PAX3⁺/SOX10标准⁻毛球黑素细胞（箭头）。KIT的三重标签进一步证明了这些PAX3⁺/SOX10标准⁻毛球黑素细胞表现出明显高于保持SOX10表达的毛球黑素细胞的KIT荧光强度（箭头）。(K)单个毛球黑素细胞每像素平均KIT荧光强度的方框和胡须图。每个毛球黑素细胞由固定直径的ROI（10μm）定义，用于包围每个PAX3⁺黑素细胞核。每个类别至少评估45个ROI，并通过Kolmogorov–Smirnov检验确定统计显著性(**P（P）*<0.0001）。(**L（左）**–N个)单独地，*Tg（Dct-Sox10）/0*和*配套元件^LacZ公司/+*基因改变使小鼠产生小白腹斑。总的来说*Sox10型*与*配套元件*单倍充足(*Tg（Dct-Sox10）/0；配套元件^LacZ公司/+*)结果出现更广泛的先天性白色斑点，出现在背部和腹部。

**图2。**
黑素细胞SOX10染色质占有率的ChIP-Seq分析。(A类)使用MEME-ChIP识别的SOX10共识序列的字母标识表示（20）。扩散系数*新生代*利用SOX10 ChIP-Seq峰[-150 bp，+150 bp]窗口内的序列进行基序分析。显示了与已知SOX10基序显著相似的一致序列。字母标志大小表示核苷酸频率和相应的E值，表示与基因组背景相比，基序丰富的重要性。(B类)Centrimo（21）分析生成的图显示了SOX10 ChIP-Seq峰下富集的一致序列相对于SOX10-结合峰的发生概率分布，即序列中最佳位置的位置。中心基序富集E值为：motif B的E值=9.1e-148；Motif A的E值=1.7e-125；显示了先前已知的SOX10基序（MA0442.1）的分布以进行比较（中心基序富集E值=1.7e-92）。(C类)使用GREAT对与SOX10峰值相关的基因进行功能GO富集分析（22）。

**图3。**
黑素细胞中SOX10-结合位点的基因组分布。(A类)饼图显示了SOX10峰值在基因特征上的分布（启动子或TSS、外显子、内含子和基因间区域周围的[-2.5 kb，+2.5 kb]窗口内）。(B类)黑素细胞中与SOX10-ChIP-Seq峰相关的基因的SOX10峰相对于TSS的基因组分布。使用GREAT（22）通过应用基础加延伸设置进行峰值和基因关联。GREAT通过分析邻近基因和调控元件的注释，为基因组区域赋予生物学意义，其中基因组距离被划分为相对于TSS的bins，如[0,5 kb]、[5 kb，50 kb]、[00 kb，500 kb]、[500 kb，无限]。上的值*Y（Y）*-轴表示在给定基因组区域中发现的峰值的百分比。条形图上显示的值表示与每个基因组窗口中峰值相关的基因数量。(C类)顶部，显示用于对SOX10 ChIP-Seq峰进行分类的基因组类别的示意图。TSS SOX10峰值=TSS的[-2.5 kb，+2.5 kb]范围内的峰值；远端基因间SOX10峰=TSS两侧>2.5 kb的峰；基因体SOX10峰值=不在TSS或基因体中的峰值。底部的线图显示平均ChIP-seq信号强度（读取计数年-轴）位于TSS、基因体和远端基因间位点的SOX10峰相对于SOX10峰的[-3000bp，+3000bp]窗口(x个-轴）。

**图4。**
黑素细胞中SOX10基因组结合与表观染色质特性之间的关系分析。(A类)维恩图显示SOX10峰与假定的黑素细胞增强因子重叠。(B类–D类)UCSC基因组浏览器跟踪显示SOX10与远端增强子元件的基因组相互作用*配套元件*,提尔、和*Sox10型*分别位于黑素细胞中。上的值年-轴表示ChIP-Seq数据的输入标准化读取计数或强度。对于所示的每个位点，箭头表示在基因组背景（输入DNA）上具有统计意义上的结合富集的重复SOX10峰。基因组浏览器轨迹下方的绿色矩形块表示推测的黑素细胞增强因子（33）。下面的数字1到9Sox10型基因组浏览器轨迹对应于*Sox10型*多物种保守序列或Sox10-MCS（24）。(E类)ChIP-Seq鉴定的SOX10顺反义体与EP300染色质占有率和组蛋白修饰（H3K4me1、H3K4me2和H3K4-me3）区域的关系。每个方块中的值表示左侧一个峰或染色质区域与顶部另一个峰或者染色质区域重叠至少1 bp的百分比。所有ChIP-Seq区域代表至少两个独立实验的重复峰值。SOX10标准(n个= 4085); EP300型[n个= 3539; (33)]; H3K4me1型[n个= 75956; (33)]; 增强功能[n个= 2489; (33)]; H3K27ac型(n个= 52 553); H3K27me3型(n个= 37 270). (F类)SOX10、H3K4me1（33）、EP300（33），H3K27ac和H3K17me3 ChIP-Seq在黑素细胞中所有SOX10占据区域的分布。对于每个因子，在SOX10峰中心（峰顶）周围的[-3kb，+3kb]窗口内绘制平均ChIP-Seq读数。

**图5。**
黑素细胞中SOX10靶基因的鉴定。(A类)火山图显示了在*Sox10型^LacZ公司/+*通过Affymetrix GeneChip®小鼠基因1.0 ST阵列上的微阵列对黑色素a RNA样本进行分析。显著性概率值(年-轴）根据Log2绘制（表达式折叠变化）(*Sox10型^LacZ公司/+*/melan-a）开启x个-轴。红色=上调；绿色=下调。水平蓝线表示未调整的重要性*P（P）*-值截断为0.05。(B类)中显著上调或下调转录物（基因）的摘要*Sox10型^LacZ公司/+*与对照组相比，FDR（B–H）调整后的黑色素a RNA样本*P（P）*< 0.05. (C类)维恩图显示了SOX10 ChIP-Seq相关基因（至少有一个SOX10-结合位点与之相关的基因）与表达在*Sox10型^LacZ公司/+*与控制黑色素a细胞相比。(D类)SOX10活化和SOX10再表达靶基因的IPA途径富集分析，即具有至少一个相关SOX10峰的基因，在*Sox10型^LacZ公司/+*与黑色素a细胞相比。上部面板，SOX10-激活靶基因；下面板，SOX10重表达靶基因。负对数10（B–H修正*P（P）*-值）表示所示途径成员富集的重要性。

**图6。**
SOX10活化基因和SOX10再表达基因具有不同的调控机制。(A类)所有SOX10-激活和SOX10--表达基因的平均表达水平。(B类)热图显示了功能性SOX10靶基因TSS周围[-3 kb，+3 kb]窗口内EP300（33）、H3K4me1（33），H3K27ac和H3K17me3的富集情况。根据相对表达变化对功能性SOX10靶基因进行排序。热图上的每一行代表一个基因。SOX10激活的靶基因位于热图的顶部，而SOX10再表达的靶基因处于热图的底部。在热图上，红色=强烈富集；黄色=弱富集，白色=无富集。(C类)UCSC基因组浏览器显示SOX10 ChIP-Seq剖面和SOX10激活的组蛋白修饰标记（H3K27ac和H3K17me3）(*数字电流互感器*基因座）和SOX10再表达(*Itpr2公司*轨迹）目标。上的值年-轴表示ChIP-Seq数据的输入标准化读取计数或强度。对于所示的每个基因座，基因组浏览器轨迹下的矩形块表示H3K27ac（红色）和H3K17me3（黑色）的ChIP-Seq峰边界。(D类)*Cis公司*-使用Cistrome Analysis Pipeline的BETA工具鉴定的黑色素细胞中与SOX10激活和SOX10抑制靶点相关的调节序列（26）。字母标志显示转录因子共识基序富含SOX10-活化和SOX10--再表达靶点。对应*P（P）*-值表示与背景（非目标）序列相比，基序丰富的重要性。

**图7。**
SOX10-介导黑素细胞转录调控的工作模型。SOX10 DNA结合介导与功能不同的通路相关的基因的转录激活和抑制。SOX10激活黑素细胞增殖和色素沉着所需的基因，抑制促进替代途径的基因，如干细胞维持和EMT/侵袭。SOX10-活化基因和SOX10--再表达基因具有不同的表观遗传组蛋白修饰以及SOX10的共同调控转录伙伴，这决定了与SOX10 DNA结合活性相关的转录结果。

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