Endothelial-like malignant glioma cells in dynamic three dimensional culture identifies a role for VEGF and FGFR in a tumor-derived angiogenic response

doi:10.18632/oncotarget.4339

.2015年9月8日；6（26）:22191-205。

doi:10.18632/目标4339。

动态三维培养内皮样恶性胶质瘤细胞确定VEGF和FGFR在肿瘤衍生血管生成反应中的作用

斯图亚特·史密斯¹, 詹妮弗·沃德¹, 克里斯托弗·谭¹, 理查德·格兰迪¹, 鲁曼·拉赫曼¹

附属机构

PMID： 26203665
预防性维修识别码：项目经理4673156
内政部： 10.18632/目标4339

动态三维培养内皮样恶性胶质瘤细胞确定VEGF和FGFR在肿瘤衍生血管生成反应中的作用

斯图亚特·史密斯等。 Oncotarget公司. 2015.

.2015年9月8日；6(26):22191-205.

doi:10.18632/目标4339。

作者

斯图亚特·史密斯¹, 詹妮弗·H·沃德¹, 克里斯托弗·谭¹, 理查德·格兰迪¹, 鲁曼·拉赫曼¹

附属

¹英国诺丁汉大学医学院儿童脑肿瘤研究中心。

PMID： 26203665
预防性维修识别码：下午4673156
内政部： 10.18632/目标4339

摘要

目的：最近的研究发现，来自高级胶质瘤的细胞能够呈现内皮表型和基因型，这一过程称为“血管生成拟态”（VM）。在这里，我们在动态三维（3D）胶质瘤培养中对VM进行建模和操作。

方法：使用旋转细胞培养系统（RCCS）获得大的宏观胶质瘤聚集物，切片进行免疫组织化学和RNA提取，然后进行血管生成阵列PCR。

结果：3D细胞培养诱导的微环境（仅包含神经胶质细胞）足以在体外促进一定比例的神经胶质瘤聚集体中内皮标志物CD105、CD31和vWF的表达。许多促血管生成基因在胶质瘤聚集物和原代外植体中上调，胶质瘤细胞在内皮促进条件下能够形成管状3D结构。血管内皮生长因子或成纤维细胞生长因子受体的竞争性抑制足以损害VM并下调肿瘤衍生的血管生成反应，同时损害肿瘤细胞衍生的小管形成。使用相同细胞的胶质瘤异种移植物在坏死区域附近显示出肿瘤衍生的血管样结构，这与原发性胶质瘤组织中广泛存在的肿瘤衍生内皮表达一致。

结论：我们的发现支持了一些研究，这些研究表明肿瘤衍生的内皮细胞出现在胶质瘤中，并将动态3D培养描述为一个真实的模型，以在体外质疑这种现象的分子基础。对当前抗血管生成疗法的耐药性以及肿瘤衍生的内皮细胞对这种耐药性的贡献可使用RCCS进行研究。

关键词：血管生成；胶质瘤；旋转细胞培养系统；肿瘤内皮；血管生成拟态。

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利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。RCCS聚集物中推测脑肿瘤衍生内皮细胞中血管基因的表达*在体外*
*高级别胶质瘤3D聚集物中CD105、CD31和vWF内皮标记物的免疫学检测。* **答：。**原发性高级别胶质瘤移植组织中微血管结构中CD105的明显表达（棕色）。B。坏死核心周围的缺氧区域(*表示为C*)使用Hypoxyprobe™（棕色）对U87骨料进行鉴定；周围致密细胞边缘无缺氧染色(*表示为R*).C、。GB-1细胞来源于原发性高级胶质瘤，界面处有膜性CD105表达（棕色）(*表示为I*)密胞集料边缘之间(*表示为R*)和坏死核心(*表示为C）*.D。膜性CD105表达的KNS42细胞（棕色）。**E.公司。**膜性CD105表达的U87细胞（棕色）。**F、。**在KNS42细胞中CD105（红色）与GFAP（绿色）的共定标。**G.公司。**U87细胞在聚集核心和局部区域显示CD105（红色）和HIF-2α（绿色）的共同定位。H。界面上广泛使用的vWF表达式(*表示为I*)密胞集料边缘之间(*表示为R*)以及相对稀疏的核心(*表示为C）*KNS42细胞。**一、。**聚集核心中的CD105表达不同(*表示为C*)和轮辋(*表示为R*)Res196室管膜瘤聚集区。两个骨料显示已收获，随后切成彼此接近的部分。J。U87细胞在聚集边缘/核心界面有明显的CD31表达（红色）。**英国。**原发性HGG组织中被GFAP阳性肿瘤细胞（绿色）包围的典型血管中CD31的显著表达（红色）。*比例尺A、C、E-H、J-K=25μm；D=10μm；B和I=200μm*.所有聚集体在RCCS中培养7-10天.

图2。脑肿瘤衍生血管生成表达在RCCS培养中上调*在体外*
血管生成阵列定量RT-PCR火山图，x轴和第页-y轴上的值。蓝色水平线表示第页-值0.05和垂直粉红色线表示+/-三倍的折叠变化。**交流-交流。**KNS42、U87和GB-1的2D和3D胶质瘤培养物中血管生成基因的表达。D。火山图的方框图表示**C、。**比较GB-1 3D和2D表达的基因表达，说明3D培养中FGF2和ANGPT1基因的显著上调。每个条形代表84个血管生成基因中的一个。**E.–F.公司。**相对于衍生细胞系的HGG原发肿瘤，GB-1 2D和3D培养物中的血管生成基因表达。**G.公司。**相对于从该外植体衍生的2D单层系T7/11，原代GBM外植体组织中血管生成基因的差异表达。H。KNS42/HBMEC异质聚集物和KNS42肿瘤聚集物之间的血管生成差异表达。对于所有实验，每个点表示在三个不同3D聚集物的三个独立RNA样本中检测的一个基因的平均基因表达，并在图上确定感兴趣的选定基因。每个实验条件（例如3D或2D）都是相对的。

**图3。胶质瘤肿瘤衍生内皮标记物表达体内**
*评估来自免疫缺陷小鼠的皮下人U87侧翼异种移植物的肿瘤衍生的内皮标记物表达。* **答：。**在U87异种移植物中，CD31人类表位表达（棕色染色）衬在血管样结构的壁上。B。异种移植瘤内CD105表达（棕色染色）衬在血管样结构内，包含可见的红细胞（箭头所示）。**C、。**肿瘤移植物周围的小鼠血管含有红细胞，但对人特异性CD105没有阳性染色。*在选定的儿童HGG中进行肿瘤和内皮标记物的免疫荧光检测。* **D.–E。**合并图像显示CD105（红色）和GFAP（绿色）在原发性HGG组织中假定TDEC上的共同定位。**F、。**原发性HGG组织中CD31（红色）和GFAP（绿色）的共定标。*比例尺A-C=25μm；D-F=20微米*.

**图4。小鼠NSC RCCS聚集物中OCT4过度表达导致CD105表达**
**答：。**CD105在小鼠ESC中的表达（棕色染色）B。CD105在小鼠NSC中无表达。**C、。**OCT4过度表达的小鼠NSC中CD105表达稀疏（棕色染色）。每个实验的三个独立集料被固定并切片，并显示代表性图像。*比例尺=25μm*.

图5。抑制VEGF或FGFR后肿瘤源性血管生成反应的下调*在体外*
血管生成阵列定量RT-PCR火山图，x轴和第页-y轴上的值。蓝色水平线表示第页-值0.05和垂直粉红色线表示+/-三倍的折叠变化。每个点代表一个基因的平均基因表达，该基因在来自三个不同3D聚集体的三个独立RNA样本中进行检测，并在图上识别出选定的基因。**答：B：。**与未经处理的KNS42聚集体相比，分别用CBO-P11 VEGF抑制剂或PD16686 FGFR抑制剂处理的KNS 42聚集体显示出处理细胞中许多血管生成相关基因的显著下调。**C.–D.公司。**用CBO-P11和PD166866处理的U87聚集体分别相对于未处理的U88聚集体，显示处理聚集体中许多基因的显著下调。所描述的血管生成基因表达代表了三个独立实验的平均值，每个实验使用三倍阵列。**E.公司。**经PD16686处理的KNS42聚集体内活性增殖水平低，Ki67阳性细胞为4%+/-0.6。**F、。**经CBO-P11处理的KNS42聚集体内活跃增殖区的局部斑块，Ki67阳性细胞的比例为18%+/-2.3。**G.公司。**经PD16686处理的U87聚集体内的任何细胞均无Ki67表达（Ki67阳性细胞的0%+/-0.0）。H。经CBO-P11处理的KNS42聚集物中Ki67的零星表达，Ki67阳性细胞为8%+/-2.9。细胞从三个独立的聚集物中计数，并使用整个聚集视野或每个聚集物的三个不同视野。给出了Ki67阳性细胞相对于细胞总数的平均+/-SEM比例，并显示了代表性图像。*比例尺E-F=200μm；G-H=25微米*

图6。VEGF或FGFR抑制导致肿瘤衍生内皮标记物表达缺失*在体外*
KNS42和U87聚集体在RCCS中培养7天，随后分别暴露于CBO-P11 VEGF抑制剂（10μM）或PD16686 FGFR抑制剂（15μM）3天。**A.–D.公司。**在KNS42细胞中暴露于任一抑制剂后，CD105和CD31均未染色。**东-西。**在U87细胞中暴露于任一抑制剂后，未出现CD105和CD31染色。*比例尺A-H=200μm。所有情况下均显示聚集物的全场视图，以表明完全没有内皮标记染色。*

图7。GBM细胞在内皮促进条件下培养时，会形成内皮细胞的形态学特征*在体外*
**答：。**在常氧（21%氧气）条件下，由KNS42细胞组成的独特内皮样管状结构。B。使用DFO诱导低氧（1%低氧）时，肾小管结构更加清晰，但平均数无显著差异（41.8+/-3.6）(第页<0.05）相对于未经处理的常氧培养物（45.4+/-6.1）。**C、。**VEGF抑制后，肾小管结构中度受损，平均肾小管数量显著减少（23.4+/-4.1肾小管）(第页<0.05）相对于未经处理的培养物。（D-E）FGFR抑制后，闭合的小管结构明显受损，小管数量减少（9.5+/-3.3）(第页<0.05）和双重VEGF/FGFR抑制（4.2+/-3.3）(第页<0.01）。**F、。**单独暴露于二甲基亚砜（FGFR抑制剂载体）不会损害小管形成，平均小管数无显著差异（47.6+/-8.4）(第页<0.05）相对于未经处理的正常氧培养物。*种子接种后48小时和抑制剂暴露后48小时拍摄代表性图像。比例尺=50μm*.

图8。作为3D微环境的结果，GBM细胞表现出肿瘤衍生的血管生成表达*在体外*
血管生成阵列定量RT-PCR火山图，x轴和第页-y轴上的值。蓝色水平线表示第页-值0.05和垂直粉红色线表示+/-三倍的折叠变化。每个点代表一个基因的平均基因表达，该基因在来自三个不同3D聚集体的三个独立RNA样本中进行检测，并在图上识别出选定的基因。**答：。**低氧条件下培养的KNS42 2D单层膜（1%O₂)相对于在常氧（21%O）下培养的KNS42 2D单层₂)显示缺氧细胞中几个血管生成相关基因显著下调，只有CDH5、TGFA、VEGFC和TEK在缺氧条件下上调。B。低氧条件下培养的KNS42 2D单层膜（1%O₂₎相对于KNS42 3D RCCS聚集体，显示在只有ID3上调的缺氧单层中大多数血管生成相关基因的显著下调。**C、。**U87 2D单层细胞缺氧培养（1%O₂₎相对于在常氧（21%O）下培养的U87 2D单层₂)显示低氧细胞中几个血管生成相关基因显著下调，只有CXCL3、S1PR1和ITGAV在低氧下上调。D。U87 2D单层细胞缺氧培养（1%O₂₎相对于U87 3D RCCS聚集体，显示缺氧单层中大多数血管生成相关基因的显著下调。

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