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.2015年9月15日;309(6):L614-24。
doi:10.1152/ajplung.00141.2015。 Epub 2015年7月2日。

中性鞘磷脂酶2是细胞因子诱导的骨骼肌钙蛋白酶激活所必需的

附属公司

中性鞘磷脂酶2是细胞因子诱导的骨骼肌钙蛋白酶激活所必需的

杰拉尔德·苏宾斯基等。 美国生理学杂志肺细胞分子生理学. .

摘要

钙蛋白酶有助于感染诱导的膈肌功能障碍,但负责钙蛋白酶激活的上游机制尚不清楚。然而,众所周知,细胞因子激活中性鞘磷脂酶(nSMase),nSMases具有下游效应,可能增加钙蛋白酶活性。我们验证了感染诱导的骨骼肌钙蛋白酶激活是nSMase激活的结果这一假设。我们给C2C12肌肉细胞注射细胞因子(20 ng/ml TNF-α,50 U/ml IL-1β,100 U/ml IFN-γ,10μg/ml LPS),以模拟体外感染的效果,并将小鼠盲肠结扎穿刺(CLP)作为体内感染模型进行研究。在细胞研究中,我们评估了鞘磷脂酶活性、亚细胞钙水平和钙蛋白酶活性,并使用化学(GW4869)和遗传(siRNA到nSMase2和nSMase3)技术确定了抑制鞘磷脂酶的效果。我们评估了隔膜力和钙蛋白酶活性,并利用GW4869抑制小鼠的鞘磷脂酶。Cytomix增加了C2C12细胞的胞浆和线粒体钙水平(P<0.001);添加GW4869阻止了这些增加(P<0.001)。Cytomix还激活了钙蛋白酶,增加了钙蛋白酶活性(P<0.02),以及钙蛋白酶介导的蛋白酶12的裂解(P<0.001)。GW4869(P<0.001)、BAPTA-AM(P<00.001)或siRNA对nSMase2的切割减弱(P<0.00),但对nSMse3的siRNA没有影响。GW4869阻止了CLP诱导的小鼠膈肌钙蛋白酶激活和膈肌无力。这些数据表明,感染诱导的膈肌钙蛋白酶激活和肌肉无力的发生需要nSMase2的激活。因此,在患者中抑制nSMase2的治疗可以防止感染引起的骨骼肌功能障碍。

关键词:钙蛋白酶;细胞因子;膈膜;脓毒症;鞘磷脂酶。

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数字

图1。
图1。
平均中性鞘磷脂酶活性(顶部)和酸性鞘磷脂酶活性水平(底部)对于经盐处理的对照C2C12细胞(黑色条)、经细胞混合处理的细胞(红色条)、经过细胞混合+GW4869处理的细胞,以及仅经GW4869治疗的细胞(蓝色条)。细胞混合诱导中性和酸性鞘磷脂酶活性水平显著增加(P(P)两种分析均<0.001;星号表示此图和所有其他图的统计显著性)。GW4869阻止了细胞因子诱导的中性鞘磷脂酶活性增加,但对酸性鞘磷脂酶的活性水平没有影响。
图2。
图2。
细胞钙成像研究。我们用胞质果皮蛋白稳定转染C2C12细胞(左边)或线粒体靶向的果皮蛋白(正确的); 这些隔室中钙水平的增加导致果皮488nm处的发光强度与408nm处发光强度的比值增加。代表性细胞研究的数据显示在顶部光发射488nm/408nm强度比的组平均数据显示在底部组平均值数据条形图的颜色编码与图1相同。488-nm发射为伪彩色绿色,408-nm发射是伪彩色蓝色。Cytomix增加了细胞溶质和线粒体钙浓度(P(P)<0.001和P(P)分别<0.002)。服用GW4869阻断了这些细胞因子诱导的反应。
图3。
图3。
半胱天冬酶12的蛋白质印迹,在左边钙蛋白酶特异性半胱天冬酶12降解产物(CSCDP)密度测定的组平均值数据如下所示正确的.条形图的颜色编码与图1中使用的相同。GAPDH蛋白印迹用作负荷控制。对C2C12细胞进行细胞混合后,CSCDP的形成增加(P(P)<0.001)和对细胞施用钙蛋白酶抑制剂3阻止了这种细胞因子介导的CSCDP增加。
图4。
图4。
顶部:评估细胞caspase 12蛋白裂解对cytomix和GW4869的反应的数据,在左边和CSCDP密度测定的组平均数据,如正确的.中部:细胞混合和BAPTA-AM对caspase 12裂解反应的评估数据,以及左边以及上CSCDP级别的组平均数据正确的.底部:不同实验组的细胞钙蛋白酶活性测定数据。条形图表示盐处理的对照细胞(黑色)、细胞混合处理的细胞(红色)、GW4869加细胞混合处理细胞(绿色)、GW48069处理细胞(蓝色)、BAPTA-AM加细胞混合治疗细胞(黄色)和单独处理BAPTA-AM.的细胞的平均数据(灰色)。细胞混合诱导CSCDP增加(P(P)<0.001),并且这种增加被GW4869或BAPTA-AM阻断。钙蛋白酶分析活性随着细胞混合反应而增加(P(P)<0.001),并且服用GW4869或BAPTA-AM可阻止这种细胞混合诱导的增加。
图5。
图5。
顶部:评估细胞caspase 12蛋白裂解对细胞混合和siRNA对nSMase2的反应的数据左边和CSCDP密度测定的组平均数据,如正确的.底部:评估细胞caspase 12蛋白裂解对cytomix和siRNA对nSMase3的反应的数据。合成nSMase2的siRNA成功降低了nSMase1蛋白水平,并减少了CSCDP对细胞混合的反应(P(P)< 0.001). 合成nSMase3的siRNA降低了nSMase 3蛋白水平,但不能阻止混合细胞诱导的CSCDP增加。
图6。
图6。
C2神经酰胺和C6神经酰胺对CSCDP形成的影响如所示顶部,具有代表性的污点显示在左边CSCDP的组平均密度测定数据显示在正确的条形图表示对照组(黑色)、C2神经酰胺组(黄色)和C6神经酰胺(蓝色)的平均数据。底部比较cytomix、C2神经酰胺和C6神经酰胺对细胞钙蛋白酶活性测定水平的影响。条形图表示对照组(黑色)、细胞混合组(红色)、C2神经酰胺组(黄色)和C6神经酰胺(蓝色)的平均数据。与对照组相比,C2神经酰胺和C6神经酰胺均增加了CSCDP的形成(P(P)<0.001),并直接测量钙蛋白酶活性(P(P)<0.001)。
图7。
图7。
顶部:cytomix和GW4869对C2C12肌球蛋白轻链(MLC)水平的影响,在左边和组平均密度测定数据正确的.底部:cytomix和GW4869对C2C12肌球蛋白重链(MHC)水平的影响左边和组平均密度测定数据正确的条表示盐处理对照C2C12细胞(黑色)、细胞混合处理细胞(红色)、GW4869加细胞混合处理的细胞(绿色)和单独使用GW4869处理的细胞的数据(蓝色)。细胞混合诱导的MLC和MHC蛋白水平降低(P(P)两种蛋白均<0.001),同时服用GW4869阻止了混合细胞介导的两种蛋白水平的降低。
图8。
图8。
顶部:取自4个实验组的膈肌条的平均比力-频率曲线:盐处理假手术对照组(黑色)、盐处理盲肠结扎穿刺(CLP)动物(红色)、GW4869处理假手术小鼠(绿色)和GW4869治疗CLP动物(蓝色)。CLP导致明显的横膈膜无力,减少了对所有测试刺激频率的反应。GW4869治疗可防止CLP诱导的虚弱,在所有刺激频率下保持力量。底部:4个实验组的钙蛋白酶活性水平。CLP诱导膈肌钙蛋白酶活性增加(P(P)<0.001)和伴随的GW4869给药阻止了这种CLP诱导的增加。

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