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.2015年8月18日；43(14):7058-69.
doi:10.1093/nar/gkv643。 Epub 2015年6月29日。

CTNNBL1促进CWC15与CDC5L的结合，并且是维持Prp19剪接体复合物丰度所必需的

Febe van Maldegem公司 1, 莎拉·马塞伦 2, 克里斯托弗·约翰逊 2, 安妮塔·钱德拉 2, 卡鲁娜·加内什 三, 马克·斯凯尔 2, 克里斯蒂娜·拉达 4
附属公司

CTNNBL1促进CWC15与CDC5L的结合，并维持Prp19剪接体复合体的丰度

费比·范·马尔德根等。 核酸研究. .

摘要

为了催化信使RNA的剪接，多种蛋白质和RNA组分在一个动态的高度编排过程中相互关联和分离。Prp19复合体是剪接机制中一个保守的基本部分，被认为有助于剪接体在催化过程中发生构象变化。动态蛋白质相互作用通常涉及高度无序的区域，很难用结构方法进行研究。利用胺交联和氢氘交换耦合质谱，我们描述了含有CTNNBL1的Prp19亚络合物的结构。CTNNBL1缺乏导致细胞分裂的延迟启动和胚胎死亡。在这里，我们表明，体外CTNNBL1增强了CWC15和CDC5L的结合，这两种核心Prp19复合蛋白都是如此，并且确定了CDC5L区域中的重叠，该区域结合CTNNBL 1或CWC15，表明这两种蛋白可能在复合物中交换位置。此外，在体内，CTNNBL1需要维持Prp19复合物的正常水平，并促进CWC15与CDC5L的相互作用。我们的结果确定了关键Prp19复合体中CTNNBL1的伴侣功能，这是维持复合体完整性和支持有效剪接所需的功能。

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数字

图1。
图1。
CTNNBL1与CDC5L的N末端区域和CWC15的C末端直接相互作用。(A类)人CTNNBL1、CDC5L和截断突变体的线性结构。显示了已知域、下拉标签和aa编号。(B类)在存在重组MBP-CDC5L片段或仅MBP对照物的情况下，在Ni-NTA树脂上拉下全长重组His-CTNNBL1。在没有His-CTNNBL1显示下拉特异性的情况下，下拉中不存在MBP蛋白。MBP-CDC5L片段C的大小与全长His-CTNNBL1的大小重叠，但可以通过使用His-CTNBL1[77–563]片段下拉来检测绑定，如右侧面板所示。星号表示用于下拉的诱饵，每个下方的面板表示输入蛋白质。分子尺寸标记（kDa）如图所示。带旁边的填充箭头表示MBP融合。(C类)人CWC15的线性结构和截断突变体。指出了预测的核定位信号NLS、标签和aa编号。(天)用DAPI染色的CWC15 HA融合蛋白A、B和C转染的HeLa细胞的共聚焦免疫荧光在左侧面板上，抗HA抗体在右侧面板上。(E类)在重组CWC15 GST融合体存在下，如在B中一样拉下His-CTNNBL1。右边的面板显示了CWC15的C末端片段与截断的His-CTNNBL1[77–563]的相互作用，通过下拉GST-CWC15片段B与仅作为对照的GST进行比较。如（B）所示，星号表示下拉诱饵，下部面板显示输入蛋白质，填充箭头标识GST融合片段。分子尺寸标记（kDa）如图所示。
图2。
图2。
CTNNBL1与CDC5L或CWC15的相互作用不同，但三者均形成稳定的亚复合物。(A类)在醋酸钾（KAc）浓度增加（0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8和1 M）和顶部MBP-CDC5L[1–195]或底部GST-CWC15[80–229]的情况下，Ni-NTA上的His-CTNNBL1[77–563]下拉。在0.11 M KAc中使用珠子进行控制下拉（-ctrl）。星号表示下拉诱饵，并显示尺寸标记（kDa）。对于每个实验，用于下拉的蛋白质被标记为输入，如下所示。(B类)Superdex-200凝胶过滤后重组人His-CTNNBL1[77–563]、CDC5L[1–195]和CWC15[80–229]蛋白混合物的SDS-PAGE分析。显示所分析馏分的洗脱体积（ml）和已知大小的馏分洗脱分子量标记物（乙醇脱氢酶（ADH）和白蛋白）。(C类)与B中一样，SEC-MALS分析了纯化的His-CTNNBL1[77–563]、CDC5L[1–195]和CWC15[80–229]的蛋白质混合物。灰色曲线显示了相对于洗脱体积（ml）（右y轴）的折射率（任意单位）。水平黑线表示摩尔质量分布，单位为g/mol（左y轴）。显示了两个观察到的峰的计算摩尔质量，其中一个大峰对应99 kDa的蛋白质复合物，另一个小蛋白复合物对应25 kDa，对应单体CWC15[80–229]片段的预测分子质量。根据洗脱主峰（细线）的紫外线吸收率，可以根据混合物中三个蛋白质片段的消光系数推断出102 kDa蛋白质复合物的化学计量比为1:1:1。
图3。
图3。
CTNNBL1在高盐条件下稳定CDC5L和CWC15的结合。(A类)在所示CDC5L MBP融合片段或MBP单独存在的情况下，下拉GST-CWC15[80–229]的谷胱甘肽Sepharose珠。输入蛋白质显示在下部面板中。开放箭头表示CDC5L片段D，对应于包含MYB结构域的N末端区域。GST-CWC15[80–229]在以下人员在场的情况下下拉(B类)MBP-CDC5L[1-195]或(C类)MBP-CDC5L[1-195]和His-CTNNBL1[77–563]在乙酸钾（KAc）浓度增加时（如图2A所示）。向下拉动0.11 M KAc（-ctrl）中的控制珠。星号表示下拉中的诱饵。输入中的蛋白质显示在下部面板上。显示尺寸标记（kDa）。
图4。
图4。
His-CTNNBL1[77–563]、CDC5L[1–195]和CWC15[80–229]配合物的差异HDX-MS分析。显示与交互区域的CTNNBL1曲面模型(A类)CWC15和(B类)CDC5L，根据高于阈值的氢/氘含量减少（蓝色）和增加（橙色）（>10%，>0.5D，t检验P（P）<0.05，见材料和方法）。该视图显示左侧的N端区域和180°水平旋转。His-CTNNBL1[77–563]与CWC15[80–229]（紫色线）的络合物的最大交换平均值（ΔHDX）如（C）中所示（见材料和方法），对应于每个蛋白质的每个氨基酸；CWC15[80–229]与CDC5L[1–195]（红线）或His-CTNNBL1[77–563]（蓝线）在D中作为二聚体；CDC5L[1–195]与（E）中的CWC15[80–229]（紫色线）相关。总之(C类)–(E类)，与三元络合物相关的ΔHDX剖面显示为绿线。交换减少超过虚线所示显著性阈值的区域为灰色阴影。肽覆盖率由x轴上每个图形底部的黄色条表示，给出aa编号。NLS1在CDC5L中的位置由黑色条表示。
图5。
图5。
CTNNBL1缺陷影响小鼠B细胞中CDC5L和PRPF19的丰度。(A类)甲醇固定小鼠静止B细胞的典型共焦免疫荧光比较CDC5L、PRPF19和DAPI染色CD19-Cre公司1+/flx公司控制（+/-）和CD19-Cre公司1−/flx（−/−）小鼠。放大框中显示单个核的信号在（−/−）图片中线性增强，以可视化特征斑点外观。直方图显示了每个细胞的平均±SEM荧光，以任意单位表示，并根据指示的细胞数量进行量化(n个)来自每个基因型的两个单独实验。星号表示未配对双尾t检验的统计显著性**P（P）=0.0016和****P（P）< 0.0001. (B类)与来自两个对照（+/-）和两个对照的PRPF8、层粘连蛋白B1和β-微管蛋白相比，休眠B细胞裂解产物中CDC5L和PRPF19的丰度CD19-Cre公司1−/flx（−/−）小鼠。(C类)western blot显示增殖B细胞裂解物中CDC5L和PRPF19相对于β-肌动蛋白的蛋白质丰度。在LPS和IL-4刺激（第0天）之前，对对照（+）和CTNNBL1缺陷（−）细胞培养物进行取样，然后每隔24小时取样一次。(天)通过q-PCR量化LPS和IL4刺激前和刺激后5 h取样的对照（+/-）和CTNNBL1缺陷（−/-）B细胞中CDC5L mRNA相对于β-2巨球蛋白（B2M）的相对丰度。显示了四个生物复制品的平均比率±SEM。使用双尾非配对t检验的统计分析未报告P（P）-值低于0.01。
图6。
图6。
CWC15依赖于CTNNBL1与Prp19复合物的有效结合体内. (A类)两只对照小鼠（+/-）和两只对照小鼠静息B细胞中内源性Prp19复合蛋白相对于β-肌动蛋白的丰度CD19-Cre公司1−/flx（−/−）小鼠。(B类)用CDC5L或CWC15特异的siRNA池转导24小时后，人U2OS细胞的细胞裂解液中CDC5L、CWC15和CTNNBL1的丰度。非靶向siRNA池用作对照。图中显示了一个具有代表性的西部地区，与β-肌动蛋白相关的蛋白质丰度量化如下，显示了三个独立实验的平均±SEM。(C类)小鼠CDC5L和PRPF19在表达人HA-CWC15或空载体（ctrl）的逆转录转导B细胞中的免疫沉淀（IP）。来自任一种细胞的转导B细胞CD19-Cre公司1+/flx公司对照小鼠（+/-）或CD19-Cre公司1−/flx（−/−）用LPS和IL-4刺激4天，然后在抗-HA树脂上进行裂解和纯化。裂解物显示用于IP的输入的1.5%。由于（−/−）样品中CDC5L和PRPF19的水平降低，对IP中使用的裂解物的量进行了调整。显示尺寸标记（kDa）。(天)根据q-PCR测量的第一内含子内含子与剪接信使RNA的比率估计剪接效率，该比率是从两种来源的静止或活化B细胞中提取的总RNACD19-Cre公司1+/flx公司控制（+/-）或CD19-Cre公司1−/flx激活后指定时间的（−/−）小鼠。从三只独立的小鼠获得平均±SEM比率。统计学P（P）显示了每个时间点的未配对单尾t检验的值。右直方图显示对照（+/-）和CTNNBL1缺陷（−/-）B细胞中相对于β-2巨球蛋白（B2M）的相对丰度mRNA。使用双尾非配对t检验的统计分析未报告P（P）-值低于0.1。
图7。
图7。
与核心Prp19复合体相关的CWC15、CTNNBL1和CDC5L亚复合体的架构。(A类)哺乳动物Prp19复合体的结构。基于生物化学和结构信息，包括纯化蛋白质的负染色电子显微镜，核心Prp19复合物被认为由PRPF19四聚体形成的延伸结构组成，其中心为卷曲-线圈区域，外部为WD40结构域。CDC5L的单个拷贝通过其不太保守的羧基末端区域（指定为剪接体相互作用域）与PRPF19四聚体的卷曲-卷曲区域相关，而包含MYB域和NLS区域的更保守的N末端部分被认为与CTNNBL1相关。还发现SPF27的一个拷贝与PRPF19四聚体的中心部分相关，该四聚体也包含PLRG1的N-末端区域。CWC15和CTNNBL1已被描述为Prp19核心外的一种单独的稳定复合物，但也被发现通过与CDC5L的N-末端区域的相互作用与Prp19复合物结合。核心Prp19复合物内的CTNNBL1/CWC15/CDC5L亚复合物（虚线椭圆）的精确构型尚未完全确定，但预计将采用线性构象。HSP7C是一种亚化学计量组分，其位置尚未确定（基于Grote的模型等. (30)). (B类)与不同剪接体复合体相关的CWC15、CTNNBL1和CDC5L之间相互作用的变化。CTNNBL1和CWC15形成一个稳定的二聚体，其N端与CWC15（橙色）的C端结合。在B和B中行为Prp19复合物是剪接体的形式，通过CTNNBL1的存在而稳定，增强了CWC15和CDC5L之间原本较弱的相互作用。CTNNBL1起桥梁作用，通过其CTD区域将CDC5L（绿色波形条）的N端NLS区域与CWC15的C端通过其N端HEAT样区域结合。这使得CDC5L（绿色三角形形式）的MYB域和CWC15（红色波形）中央部分的区域之间可以进行三向交互，从而促进绑定。这种稳定的三向相互作用维持了B和B中Prp19复合体的正常水平行为剪接体。在剪接体复合体的晚期C阶段，不存在CTNNBL1，CDC5L的NLS区域可以与CWC15的C末端区域相互作用。
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