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.2015年7月1:6:7286。
doi:10.1038/ncomms8286。

Rac/Cdc42交换因子复合物促进外侧丝足的形成和血管管腔形态发生

萨布·亚伯拉罕 1, 玛格丽塔·斯卡西亚 2, 理查德·巴格肖 三, 凯瑟琳·麦克马洪 2, 加里·格兰特 2, 特蕾西·哈维 2, 杨美琪（Maggie Yeo） 1, Filomena O G酯类 2, 海伦·H·蒂格森 2, 帕梅拉·琼斯 4, 瓦莱丽·斯皮尔斯 2, 安德鲁·汉比 2, 彼得·塞尔比 2, 米哈拉·洛格 2, T Neil亲爱的 4, 托尼·鲍森 三, 克里斯托弗·马歇尔 1, 乔治亚·马夫里亚 2
附属公司

Rac/Cdc42交换因子复合物促进外侧丝足的形成和血管管腔形态发生

萨布·亚伯拉罕等。 国家公社. .

摘要

在血管生成过程中，Rho-GTPases影响内皮细胞迁移和细胞间粘附；然而，尚不清楚它们是否控制血管内腔的形成，而血管内腔对血液流动至关重要。这里，我们使用一个器官型系统来重述VEGF依赖性血管生成的不同阶段，我们表明管腔的形成需要早期细胞骨架重塑和侧向细胞-细胞接触，通过RAC1鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）DOCK4（胞质分裂4的供体）介导。DOCK4信号对于侧丝足突和管腔形成之前的小管重塑是必要的，而近端、尖端丝足突在没有DOCK4的情况下持续存在。通过DOCK4激活VEGF依赖性Rac对于CDC42激活以信号丝状伪足形成是必要的，并且依赖于通过RHOG GEF（SGEF）激活RHOG。VEGF促进DOCK4与CDC42 GEF DOCK9的相互作用。这些研究确定了一种新的Rho家族GTPase激活级联反应，用于形成小管重塑所需的内皮细胞丝状突起，从而影响管腔形态发生的后续阶段。

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数字

图1
图1。Rac GEF DOCK4控制侧向重塑和管腔形成
(一)接种到CF上3天后，HUVEC中DOCK4缺失（EV，空载体；ot，靶上加siRNA；sh，shRNA1；sp，智能池siRNA）后的簇形成（箭头）。比例尺，100 微米。散点图：聚类量化，n个=延时电影数量（EV，n个=17; 不沉默，n个=12；DOCK4第1页，n个=18; 嘲弄，n个=6；无目标，n个=6；DOCK4标准件，n个=6；DOCK4号，n个=6） 来自独立实验（EV，n个=三；DOCK4第1页，n个=三；不沉默，n个=2; 嘲弄，n个=2; 无目标，n个=2; DOCK4 sp，n个=2; DOCK4号，n个=2); 线条代表平均值。通过定量PCR（DOCK4-sp，ot）或免疫印迹（DOCK4-sh；如补充图所示。1k）定量敲除。(b条)将HUVEC接种到CFs后2天，DOCK4耗竭后VE-cadherin表达。（i） 和（ii）：轮廓框的放大倍数。比例尺，50 微米。(c（c）)DOCK4耗尽后的分支形成（箭头），如b条将HUVEC接种到CF后7天。比例尺，100 微米。直方图：分支点索引。对于每个值，支管数除以小管长度±s.e.m。；n个=器官型共培养物的数量（EV，n个=8; 不沉默，n个=11; DOCK4第1页，n个=8; DOCK4第2页，n个=11） 来自独立实验（EV，n个=三；不沉默，n个=4; DOCK4第1页，n个=三；DOCK4第2页，n个=4). (d日)接种DOCK4缺失的HUVEC后7天，VE-cadherin表达b条.比例尺25 微米。(e（电子）)DOCK4耗尽后流明形成（星号），如c（c）播种到CF后14天。3D重建来自共焦Z堆栈（补充电影1和2）。比例尺，25 微米。散点图：流明长度占总长度的百分比，n个=器官型共培养物的数量（DOCK4 sh1，n个=11; DOCK4第2页，n个=6；电动汽车，n个=15；非沉默，n个=7） 来自独立实验（DOCK4 sh1，n个=2; DOCK4第2页，n个=2; 电动汽车，n个=三；不沉默，n个=2); 线条代表平均值。(（f）)补充电影3和4中的图像显示，接种CF后4天，DOCK4耗竭（shRNA1，sh；EV，空载体）后小管形成。箭头：白色，突出物持续>5 h；红色，尖端伸长。比例尺，50 微米。直方图：数量超过48 突出物持续时间>5小时 h±s.e.m。；n个=延时电影数量（DOCK4 sh，n个=19; 不沉默，n个=11; 电动汽车，n个=11） 来自独立实验（DOCK4 sh，n个=三；不沉默，n个=2; 电动汽车，n个=2） 。(克)直方图：量化超过48 吻合口h±s.e.m。；n个=延时电影的数量（非静音，n个=11; DOCK4第页，n个=19; 电动汽车，n个=17） 来自独立实验（非沉默，n个=2; DOCK4第1页，n个=三；EV中，n个=3); NS，双尾不显著t吨-测试。补充电影5和6中的图像显示了补充图1j中的吻合*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001; NS，双尾不显著t吨测试。
图2
图2。Rac活化通过RhoG和Cdc42控制小管形成
(一)VEGF（25）刺激HUVEC中DOCK4缺失（si，smartpool siRNA）后Rac1激活（GTP-bound Rac/total Rac） 纳克 毫升−1)，条形表示s.e.m。；n个=4个独立实验。补充图1k显示了shRNA-介导的DOCK4缺失后Rac1的激活。(b条)器官型共培养（CD31染色）的图像显示，接种CFs 5天后，HUVEC中Rho-GTPase缺失（siRNA，si）后的小管形态。比例尺，200 微米。顶部直方图：小管总长度、小管数量、支点数量±标准偏差的量化。；n个=独立实验的数量（非目标，n个=4; Rac1、，n个=三；RhoG、，n个=4; Cdc42，n个=3); 每个实验中量化三种共培养物。表显示了定量PCR定量的敲除。下部直方图：分支点索引。棒材代表由管子长度±s.e.m.划分的接头。；n个=独立实验的数量，如b条. *P（P）<0.05; **P（P）双尾<0.01t吨-与非靶向对照进行比较。
图3
图3。横向丝状伪足形成和Cdc42激活需要DOCK4
(一)VEGF刺激后器官型共培养中丝虫的共焦图像（25 纳克 毫升−1). 将HUVEC–EGFP接种到CF上，4天后用含有VEGF的培养基补充培养基。共培养在24小时后拍摄 h.比例尺，50 微米。(b条)VEGF（25 纳克 毫升−1)将DOCK4缺失的HUVEC（EV，空载体；sh，shRNA1）接种到CF后6天。比例尺，25 微米。(c（c）)丝状伪足的共焦图像，如b条Rac1或DOCK4耗尽后（EV，空载体；sh1，shRNA1）。图像是共焦Z堆栈的最大强度投影。比例尺，50 微米。直方图：丝状体量化，误差条表示标准偏差。；n个=器官型共培养物的数量（EV，n个=8; Rac sh1、，n个=6；DOCK4第1页，n个=6） 来自独立实验（EV，n个=三；Rac sh1、，n个=2; DOCK4第1页，n个=3). 通过免疫印迹定量敲除（补充图1k和2a）。(d日)共聚焦图像显示小管内持续存在尖端丝状伪足（红色箭头），DOCK4缺失，如b条.比例尺，50 微米。(e（电子）)0.01治疗 微克 毫升−1Latrunculin B（LatB）阻断外侧丝足。共培养48个 将HUVEC接种到CF后6天开始。中间面板显示单个共焦Z堆叠（星号，焦点级别）中的丝状体。比例尺，50 微米。(（f）)直方图：将HUVEC接种到CF后14天和48天后流明长度的量化 小时0.01 微克 毫升−1LatB治疗在第3、6和9天（总治疗6天）与未治疗的对照组相比。每个值表示流明长度占总长度±s.e.m.的百分比。；n个=每种条件下共培养4个器官型。补充图3c、d显示了LatB处理后的粘附连接和细管形态。（g）通过VEGF刺激激活Cdc42的免疫印迹（25 纳克 毫升−1)在耗尽Rac1（ol1，siRNA寡核苷酸1）后的HUVEC中。直方图：Rac1缺失（si，siRNA寡核苷酸1）后折叠Cdc42激活（GTP-bound Cdc42/总Cdc42），误差条表示s.e.m。；n个=3个独立实验；补充图3e显示了通过shRNA-介导的Rac1敲除激活Cdc42。（小时）)EGFP–Rac1过度表达和Cdc42（si，siRNA）基因敲除后的类阴茎激素染色的293T细胞图像。载体（EGFP）和EGFP–Rac1（顶面板）与非靶向siRNA共同转染。补充图3g中更宽区域的图像。比例尺，25 微米。直方图：丝状体量化，误差条表示标准偏差。；n个=来自两个独立实验的30个细胞。(我)4号码头→种族1→Cdc42信号模块调节丝状伪足的形成*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001（双尾）t吨测试。
图4
图4。RhoG和SGEF控制Rac1激活和侧丝足虫形成
(一)血管内皮生长因子刺激下Rac1激活的免疫印迹（25 纳克 毫升−1)RhoG缺失（si，siRNA智能池）后在HUVEC中。直方图：血管内皮生长因子刺激后Rac1激活倍数增加（GTP-bound Rac/total Rac）。误差线代表s.e.m。；n个=独立实验（15 最小值，n个=3; 30 最小值和60 最小值，n个=5). 补充图4a显示了靶向寡核苷酸耗尽后Rac活化的RhoG要求。(b条)免疫印迹显示30天后HUVEC中激活的RhoG水平 最小VEGF刺激（25 纳克 毫升−1)以及Trio、SGEF或FLJ10665（si、siRNA智能池）耗尽后。直方图：与VEGF处理的非靶向对照组相比，RhoG激活折叠（GTP-bound RhoG/总RhoG）。误差条代表标准误差(n个＝3个独立实验）。补充图4c显示了用靶向寡核苷酸阻断VEGF刺激的RhoG激活SGEF耗竭。(c（c）)图像显示，将HUVEC接种到CF后5天，用VEGF处理的共培养物（补充图1a）中RhoG或SGEF缺失（ot，靶向+寡核苷酸；si，siRNA智能池）后CD31染色的丝状体丢失。箭头：尖端丝足；（i–iv）：主图像中轮廓区域的放大倍数。比例尺，100 微米。直方图：上图，总丝状伪足的定量；下部面板，侧丝足（红点）和尖端丝足（白点）的量化。误差线s.e.m。；n个=器官型共培养物的数量（Scr±VEGF，n个=7; RhoG，n个=5; SGEFot5，n个=6；SGEFot6，n个=6；DOCK4ot11号码头，n个=三；三重奏5，n个=6；三重奏7，n个=6） 来自独立实验（Scr±VEGF，n个=三；RhoG、，n个=2; SGEFot5，n个=三；SGEFot6，n个=三；DOCK4ot11号码头，n个=2; 三重奏5，n个=三；三人组ot7，n个=3). 表显示了定量PCR定量的敲除。(d日)上部面板的免疫印迹：RhoG过度表达的HEK293T细胞中Rac1激活；下图：通过蛋白质印迹检测RhoG和DOCK4水平。(e（电子）)RhoG（节奏）→4号码头→Rac1信号模块控制横向丝状伪足的形成*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001（双尾）t吨-与指示的对照组进行比较。
图5
图5。需要DOCK4才能激活依赖DOCK9的Cdc42和丝状伪足形成
(一)VEGF刺激下Cdc42激活的免疫印迹（25 纳克 毫升−1)在DOCK4耗竭后的HUVEC中（智能池siRNA）。直方图：DOCK4耗尽后HUVEC中折叠Cdc42激活（GTP-bound Cdc42/总Cdc42）；误差线表示s.e.m。；n个=3个独立实验）。补充图5a显示了用靶向寡核苷酸阻断DOCK4缺失时Cdc42的激活。(b条)免疫印迹显示30天后HUVEC中激活的Cdc42水平 最小VEGF刺激（25 纳克 毫升−1)以及DOCK9、DOCK10或DOCK11（si，siRNA智能池）耗尽后。直方图：与VEGF处理的非靶向对照组相比，Cdc42激活倍数（GTP结合的Cdc42/总Cdc42）。误差条s.e.m(n个=3个独立实验）。(c（c）)小管图像（CD31染色）显示，在接种到CFs后5天，用VEGF处理的共培养物（补充图1a）中，DOCK9缺失（ot，靶向+寡核苷酸；si，siRNA智能池）后，小管形成丝状伪足。箭头：尖端丝足；（i–vi）：主图像中方框的放大倍数。比例尺，100 微米。直方图：总丝足（上面板）和侧面或尖端丝足（下面板）的量化。误差线代表s.e.m。；n个=器官型共培养物的数量（Scr±VEGF，n个=6；DOCK9ot10，码头，n个=6；码头9 ot11，n个=5） 来自独立实验（Scr±VEGF，n个=三；DOCK9ot10，码头，n个=三；码头9 ot11，n个=2） 。通过定量PCR对敲除进行定量。(d日)上部面板的免疫印迹：Rac1和RhoG过度表达的293T细胞中的Cdc42激活；中下部面板的免疫印迹：Rac1、RhoG、DOCK4和DOCK9的水平。(e（电子）)SGEF公司→RhoG（节奏）→码头4→种族1→9号码头→Cdc42信号模块控制横向丝状伪足的形成*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001（双尾）t吨-与指示的对照组进行比较。
图6
图6。Rac GEF DOCK4和Cdc42 GEF DOCK9位于一个综合体中
(一)通过IP对293T过度表达的3×Flag–DOCK9细胞进行质谱分析（补充表3中的DOCK9相互作用伙伴）。(b条)上部面板显示，在GFP–DOCK4和空载体（GFP）过度表达和免疫沉淀DOCK9后，DOCK9中的DOCK4免疫印迹或对照IgG免疫沉淀复合物（IP）。下部面板显示GFP–DOCK4过度表达和总裂解物（TL）中的空载体（GFP）。(c（c）)VEGF刺激后DOCK9 IP中DOCK4的免疫印迹（25 纳克 毫升−1)Rac1敲除后（Rac1 si，siRNA ol1）。IP中DOCK9和总裂解物（TL）中DOCK4归一化后，DOCK4-DOCK9相互作用与未刺激对照组相比增加了倍。(d日)293T中DOCK4野生型或缺失突变体过度表达后，DOCK9 IP中Flag-DOCK4的免疫印迹显示，与DOCK9相互作用需要DOCK4-SH3和DHR2结构域。(e（电子）)GST–SH3下拉框（PLs）中DOCK9的免疫印迹。右侧面板：通过Coomasie Brilliant Blue（CBB）染色显示GST蛋白。(（f）)分别击倒DOCK4和DOCK9后，GST–ELMO PLs中DOCK9（左面板）和DOCK4（右面板）的免疫机器人显示DOCK4对于DOCK9与ELMO的相互作用是必要的。(克)CD31染色显示，接种到CFs后5天，用VEGF（补充图1a）处理的共培养物中，酶蛋白缺失（si，siRNA智能池）后形成丝状体。箭头：尖端丝足。比例尺，100 微米。直方图：总丝足（上面板）和侧面或尖端丝足（下面板）的量化。误差线s.e.m。；n个=来自两个独立实验的4个器官型共培养物。通过定量PCR定量敲除。P（P）<0.001（双尾）t吨-与指示的对照进行比较。
图7
图7。DOCK4控制肿瘤管腔的形成
(一)DOCK4 shRNA转导血管室后，用内切粘蛋白免疫染色的切片图像显示BE异种移植瘤中的血管。比例尺，50 微米。直方图：单个肿瘤中管腔血管计数占总血管计数的百分比，误差线表示标准误差。；n个=12个显微镜视野，代表三种不同的肿瘤水平。(b条)肿瘤切片的CAIX染色显示缺氧区域。比例尺，200 微米。(c（c）)EO771移植瘤的流明分析码头4野生型（WT）和杂合子（Het）小鼠（每种情况下有三个肿瘤）。左散点图：平均流明宽度；右散点图：管腔大小的频率；n个=每个肿瘤的4个平铺图像代表两个肿瘤级别，每个图像跨越肿瘤部分*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001（双尾）t吨-与指示的对照组进行比较。
图8
图8。Rac GEF DOCK4调控丝状伪足形成和管腔形态发生的模型
(一)有无DOCK4时小管发育和管腔形成的阶段。通过外侧丝状体和突起进行的动态重塑导致内腔形成，内腔由对置的内皮细胞排列。在没有DOCK4的情况下，缺乏动态前伸活动和动态重塑导致细管缺乏侧细胞-细胞接触，无法形成管腔。(b条)VEGF下游的信号传导激活SGEF→RhoG（节奏）→4号码头→种族1→9号码头→Cdc42信号通路并促进Rac GEF DOCK4与Cdc42 DOCK9的相互作用。
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