Mio depletion links mTOR regulation to Aurora A and Plk1 activation at mitotic centrosomes

doi:10.1083/jcb.201410001

.2015年7月6日；210(1):45-62.

doi:10.1083/jcb.201410001。 Epub 2015年6月29日。

Mio耗竭将mTOR调节与有丝分裂中心体的Aurora A和Plk1激活联系起来

梅尔波梅尼·普拉塔尼¹, 劳拉·特林克尔·穆尔卡希², 迈克尔·波特³, 阿罗基娅·杰亚普拉卡什⁴, 威廉·C·恩萧¹

附属公司

¹英国苏格兰爱丁堡EH9 3BF爱丁堡大学细胞生物学研究所Wellcome细胞生物学信托中心m.platani@ed.ac.uk Bill.Earnshaw@ed.ac.uk。
²渥太华大学细胞与分子医学系，安大略省渥太华K1H8M5，加拿大渥太华大学渥太华系统生物学研究所，安大略省渥太华K1H8M5。
³英国苏格兰邓迪DD1 5EH邓迪大学生命科学学院基因调控与表达中心。
⁴英国苏格兰爱丁堡EH9 3BF爱丁堡大学细胞生物学研究所威康信托中心。

PMID： 26124292
预防性维修识别码：项目经理4494011
内政部： 10.1083/jcb.201410001

Mio耗竭将mTOR调节与有丝分裂中心体的Aurora A和Plk1激活联系起来

梅尔波梅尼·普拉塔尼等。 J细胞生物学. 2015.

.2015年7月6日；210(1):45-62.

doi:10.1083/jcb.201410001。 Epub 2015年6月29日。

作者

梅尔波梅尼·普拉塔尼¹, 劳拉·特林克尔·穆尔卡希², 迈克尔·波特³, 阿罗基娅·杰亚普拉卡什⁴, 威廉·恩肖¹

附属公司

¹英国苏格兰爱丁堡EH9 3BF爱丁堡大学细胞生物学研究所Wellcome细胞生物学信托中心m.platani@ed.ac.uk Bill.Earnshaw@ed.ac.uk。
²加拿大安大略省渥太华市渥太华大学细胞和分子医学系K1H8M5，加拿大渥太华系统生物学研究所，加拿大安大略省渥太瓦市渥太瓦大学K1H8M。
³英国苏格兰邓迪DD1 5EH邓迪大学生命科学学院基因调控与表达中心。
⁴英国苏格兰爱丁堡EH9 3BF爱丁堡大学细胞生物学研究所威康信托中心。

PMID： 26124292
预防性维修识别码： 2011年4月4日
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摘要

雷帕霉素（mTOR）信号转导的哺乳动物靶点介导了细胞生长和增殖对营养供应的响应。在这项研究中，我们报道了Mio，一种激活mTORC1激酶所必需的SEACAT/GATOR2复合物的高度保守成员，通过调节中心体和纺锤体极处活性关键有丝分裂激酶Plk1和Aurora a的适当浓度，在有丝分裂纺锤体的形成和随后的染色体分离中起着关键作用。Mio-deaked细胞在纺锤体两极的Plk1和Aurora A激酶活性降低，MCAK和HURP定位受损，MCAK和HHRP是有丝分裂纺锤体形成的两个关键调节因子，也是Aurora A激酶的已知底物，导致纺锤体组装和胞质分裂缺陷。我们的结果表明，Mio在有丝分裂中的一个主要功能是调节Plk1和Aurora a的激活/失活，可能是通过将它们与mTOR信号通路联系起来，以促进有丝分裂的忠实进展。

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数字

**图1。**
**Seh1在间期和有丝分裂中与SEACAT复合体相互作用。**（A）从稳定表达GFP-Seh1、HeLa的细胞系中纯化Seh1复合物^EGP-SEH1型GFP-Seh1复合物免疫纯化前，细胞在SILAC培养基中生长，用同位素氨基酸进行差异标记。在有指示的情况下，使用200 ng/ml诺卡唑阻止细胞有丝分裂14小时。通过定量质谱分析免疫纯化的GFP-Seh1复合物。图中显示了所有定量蛋白质的对数H/M与相对丰度（由分子量归一化的总肽强度）的关系。诱饵蛋白GFP-Seh1（绿色圆圈）和相互作用物Nup107复合物（紫色钻石）和SEACAT/GATOR2复合物（蓝色钻石）突出显示。在异步细胞群中进行了两次无偏见的定量实验，在有丝分裂阻滞的细胞中进行了一次，并使用特定抗体通过免疫沉淀/Western blot分析选择了最热门的进行靶向随访验证。（B） Mio在哺乳动物细胞中与Seh1相互作用。免疫沉淀物（IP）显示了转染mCherry、mCherry-Mio和EGFP-Seh1的HeLa细胞的总蛋白提取物。使用α-RFP粘合剂进行免疫沉淀，并使用α-Seh1抗体检测Seh1。（C）用与阴性对照和Seh1相对应的siRNAs处理的HeLa细胞裂解物的免疫印迹（用α-Mio和α-Seh1探测）表明，Seh1的缺失会影响Mio的稳定性。（D）用对应于阴性对照的siRNA和Mio（用α-Mio探测）处理的HeLa细胞裂解物的免疫印迹显示，转染48小时后，不同siRNA寡聚体可有效去除Mio蛋白。（C和D）Tubulin用作加载控制。（E） Mio耗尽后检测到异常核形态。用DAPI对转染对照和Mio-siRNA寡核苷酸48小时的HeLa细胞进行染色，以显示DNA和核形态。（F） Mio耗竭增加有丝分裂长度、双核化和凋亡。将转染对照或Mio-siRNAs的HeLa细胞孵育30小时，然后再进行19小时的相控成像。每隔15分钟采集图像，然后分析图像序列，追踪单个对照(n个=132）和Mio耗尽电池(n个=289）以确定其行为。活对照细胞或灭活细胞的命运曲线显示为时间的函数。条形图表示单个细胞在不同细胞周期阶段所花费的总时间。起点T=0为NEBD。棒材，10µm。

**图2。**
**Mio是有丝分裂进程所必需的。**（A）转染后48小时对照细胞（蓝条）和灭活细胞（红条）的有丝分裂指数(n个= 3). （B） Mio的耗尽导致纺锤体组装和胞质分裂缺陷。从延时图像中选择的最大强度投影显示有丝分裂和胞质分裂缺陷。稳定表达EGFP-tubulin（绿色）和mRFP-H2B（红色）的HeLa细胞系，HeLa^{EGFP管蛋白-mRFPH2B}用Mio siRNA寡核苷酸转染。在46小时每5分钟收集一次图像，持续120分钟。数字表示时间，单位为小时/分钟/秒。（C）对照细胞（蓝色条）和Mio-缺失细胞（红色条）不同有丝分裂阶段的定量；n个= 3). （D）对照细胞和Mio缺失细胞中微核和染色质桥的定量。误差条代表转染48小时后对照组（蓝色条）和Mio-缺失细胞（红色条）的SD。（E）双核指数(n个= 3). （F）来自活细胞视频的对照细胞（蓝色）和Mio-siRNA-处理细胞（红色）中，NEBD为T=0的后期发病有丝分裂进展散点图。统计显著性由双尾非配对t吨测试。（G） B组处理细胞中正常和定向错误细胞分裂的定量(n个= 3). 棒材，10µm。

**图3。**
**Mio耗尽导致纺锤体定向错误和中心体缺陷。**（A） Mio耗尽后检测到异常纺锤体形态。用对照和Mio-siRNA寡核苷酸转染HeLa细胞48小时，并用α-微管蛋白染色。（B）对照细胞（蓝色）和Mio-缺失细胞（红色）之间中期纺锤体长度的定量显示，有丝分裂纺锤体的长度没有显著变化。（C）描述相对于纤维连接蛋白基质的纺锤角（α）测量的示意图。（D）对照组（蓝色）和缺Mio细胞（红色）之间中期纺锤角的量化显示显著增加>20^o（o）主轴角度。n个=40，来自三个实验。（E）中心体和纺锤体数目不等的有丝分裂中期细胞的定量。右侧显示了用α-中心蛋白（绿色）、α-微管蛋白（红色）和DNA（蓝色）免疫染色的代表性中期细胞的3D最大强度投影。每种条件300个电池(n个= 3). 棒材，10µm。

**图4。**
**双极纺锤体的形成在缺钾细胞中被延迟。**（A）用Eg5抑制剂Monastrol将对照和Mio耗竭的细胞阻滞3小时。用新鲜培养基冲洗药物，并在指定的时间点固定细胞。用α-微管蛋白（红色）和α-ACA（绿色）对细胞进行免疫染色。（B）在Monastrol释放后的指定时间点，对对照细胞和Mio缺失细胞的纺锤体和染色体排列状态进行定量。300个细胞/时间点(n个= 3). 棒材，10µm。

**图5。**
**Mio-deaked细胞对Plk1和Aurora A抑制表现出敏感性。**（A） siRNA转染后46 h，将1.5 h培养至指定浓度的ZM447439、BI2356和MLN8237，对对照组（虚线）和Mio-缺失细胞（实线）的单极纺锤体进行定量。（B）在每个指示的药物浓度下，对照细胞和Mio缺失细胞之间单极纺锤体百分比的差异（Δ）。（C–E）siRNA转染后48小时，对照细胞和Mio缺失细胞的有丝分裂特征，然后在指定浓度的BI2356（C）、MLN8237（D）和ZM447439（E）中培养1.5小时。（A–E）每种条件/药物浓度300个细胞(n个= 3). 误差条代表SD。单极纺锤体有丝分裂期的高亮灰色区域用于A和B中的图形。

**图6。**
**在Mio耗尽后，Plk1和Aurora A被错误调节。**（A）将对照细胞和缺失Mio的细胞固定，并用α-极光A（红色）、α-微管蛋白（绿色）和DNA（蓝色）进行免疫染色。箭头指向中心体。（B）用α-p–Aurora A固定并免疫染色对照细胞和缺失Mio的细胞^T288型（绿色）、α-微管蛋白（红色）和DNA（蓝色）。（C）将对照细胞和缺失Mio的细胞固定，并用α-Plk1（红色）、α-微管蛋白（绿色）和DNA（蓝色）进行免疫染色。箭头指向中心体。（D）极光A和p–极光A的量化^T288型控制细胞和Mio耗尽细胞中纺锤极的水平。Mio消耗减少p–Aurora A^T288型水平，而极光A大部分被保留。（E） PLK1和p-PLK1的量化图^T210型对照细胞和Mio缺失细胞中心体的水平。Plk1和p-Plkl^T120型中心体的水平降低。（D和E）荧光强度以任意单位（AU）表示。误差条表示HeLa细胞裂解物的SD（F和G）免疫印迹，该细胞裂解物用与阴性对照相对应的siRNAs和来自异步和Monastrol阻滞细胞的Mio处理（使用α-PLK1、α-p-PLK1探测^第210页α-极光A和α-p-极光^T288型)显示极光A的减少^{T288英里/小时}Mio耗尽时发出信号，而总极光A、Plk1和Plkl^{T210英里/小时}级别看起来没有变化。Tubulin用作加载控制。不另作说明，不重要。棒材，10µm。

**图7。**
**在Mio耗尽后，主轴装配系数HURP和MCAK被错误调节。**（A）用α-HURP（绿色）、α-微管蛋白（红色）和DNA（蓝色）对对照细胞和缺失Mio的细胞进行固定和免疫染色。（B）转染GFP-MCAK（绿色）的对照细胞和去Mio细胞被固定，并用α-中心蛋白（红色）和DNA（蓝色）进行免疫染色。（C）用α-MPM2（红色）、α-微管蛋白（绿色）和DNA（蓝色）对对照细胞和缺失Mio的细胞进行固定和免疫染色。棒材，10µm。

**图8。**
**当环/PHD结构域缺失时，有丝分裂进展受损。**（A）示意图显示了Mio的域结构及其C端环/PHD域的序列。预测的参与锌配位的半胱氨酸和组氨酸用红色标记。（B）Mio C末端环/PHD结构域预测的3D分子结构的卡通表示，以棒状显示突变的残基。锌离子用球形表示（如白色球体）。（C）对照组（蓝色）、Mio-siRNA-处理细胞中NEBD为T=0的有丝分裂进展散点图，有无野生型GFP-Mio（绿色）、GFP-Mio-siRNA耐药版本的siRNA表达（红色）^环8A（黑色）和GFP-Mio^ΔPHD（紫色）来自实时手机视频。n个=来自两个独立实验的214个细胞。统计显著性由未配对学生的t吨测试。

**图9。**
**Mio耗竭后，有丝分裂细胞中mTOR的活性降低。**（A）将对照细胞和缺失Mio的细胞固定，并用α-p-mTOR（Ser2481；绿色）、α-微管蛋白（红色）和DNA（蓝色）进行免疫染色。（B）将对照细胞和灭活细胞固定，并用α–p-mTOR（Ser2481；绿色）、γ-微管蛋白（红色）和DNA（蓝色）进行免疫染色。（C）用α-mTOR（绿色）、α-微管蛋白（红色）和DNA（蓝色）对对照细胞和缺失Mio的细胞进行固定和免疫染色。棒材，10µm。

**图10。**
**Mio耗竭后，有丝分裂细胞中mTOR的活性降低。**（A） p–极光A的量化^T288型对照细胞、Mio耗尽细胞和Mio/PPP6C共耗尽细胞中纺锤极的水平。（B） siRNA转染48小时后，对照细胞、Mio缺失细胞和Mio/PPP6C共同缺失细胞的有丝分裂图谱。每种条件300个电池(n个= 3). （C和F）用与阴性对照、Mio、Mio和PPP6C、PTEN处理的HeLa细胞裂解物的免疫印迹，以及来自异步细胞的Mio/PTEN（使用α-Mio、α-PPP6C和α-PTEN探测），显示Mio、PPP6C和PTEN的有效耗竭。Tubulin用作加载控制。（D）极光A和p–极光A的量化^T288型对照细胞、Mio耗尽细胞和Mio/PTEN共耗尽细胞纺锤体极点的水平。PTEN与Mio共同耗尽拯救p–Aurora A^T288型水平降低。（E） siRNA转染48小时后，对照细胞、Mio缺失细胞以及Mio和PTEN共同缺失细胞的有丝分裂图谱。每种条件300个电池(n个= 3). （G）极光A和p–极光A的量化^T288型二甲基亚砜和雷帕霉素处理的对照细胞纺锤极的水平。（A、D和G）荧光强度以任意单位（AU）表示。（H）对照DMSO和雷帕霉素处理的细胞被固定，并用α-中心蛋白（绿色）、α-微管蛋白（红色）和DNA（蓝色）进行免疫染色。（一）培养4小时后对照二甲基亚砜和雷帕霉素处理细胞的有丝分裂特征(n个= 3). 误差条表示标准偏差，不重要。棒材，10µm。

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